一种辐照PBMC提高NK细胞扩增培养的方法与流程

本发明属于生物，尤其涉及一种通过辐照pbmc滋养层细胞提高nk细胞扩增培养的方法。

背景技术：

1、自然杀伤细胞(nk细胞)为一种天然免疫细胞，具有直接杀伤恶性细胞能力，被认为是一种极具前途的免疫治疗工具。为了获得大量的高纯度和高细胞毒性的nk细胞，本领域已经开发出了多种策略用于nk细胞的扩增培养，外周血单个核细胞(pbmc细胞)滋养层培养是其中之一。

2、pbmc细胞是nk细胞的主要来源之一，具有采集容易、易于体外扩增、无毒副作用等特点。但是pbmc细胞中nk细胞仅10％-15％，需要进行大量的体外扩增培养。对于pbmc来源的nk细胞的扩增培养通常采用因子法或使用饲养层细胞与细胞因子或/和抗体搭配的组合来刺激nk细胞的体外扩增，常用因子法包括il-2+il-18、il-15+il-21+il-1、il-2+il-15+il-18的组合以及细胞因子il-2+il-12+il-18+抗cd56抗体+抗cd16抗体+抗cd355抗体的组合等(biondo,r.等，(2024)impact of il-21on natural killer cell proliferationand function-a mathematical and functional assessment.biorxiv,2024-01；becker-hapak,m.k.,等，(2021)afusion protein complex that combines il12,il15,and il18signaling to induce memory-like nk cells for cancercancerimmunology research,9,1071-1087；parrish-novak,j.等，(2000)interleukin 21andits receptor are involved in nk cell expansion and regulation of lymphocytefunction.nature,408(6808),57-63.)；滋养层细胞培养常用滋养层细胞与细胞因子及细胞因子与抗体的联合使用(shman,tatsiana v.等，(2023)phenotypic and functionalcharacterisation of locally produced natural killer cells ex vivo expandedwith the k562-41bbl-mbil21 cell line.clinical and experimental medicine 23,no.6:2551-2560；于明晓等，(2022)一种体外扩增nk细胞的新方法.advances in clinicalmedicine 12:9059.)。这些不同的扩增系统显示出相当不同的nk细胞扩增效率水平，14天扩增效率从数十倍到数百倍不等。

3、本发明人通过对滋养层pbmc细胞进行辐照处理，极大提高了nk细胞的扩增效率,并且有批间稳定性且纯度高的优势。

技术实现思路

1、为解决现有技术中存在的问题，发明人对滋养层pbmc细胞进行处理试验并分析nk细胞的扩增情况，发现通过滋养层pbmc细胞进行一定剂量的辐照处理，极大提高了nk细胞的扩增效率。

2、因此，本发明涉及一种辐照pbmc提高nk细胞扩增培养的方法，其包括步骤：

3、(1)将nk细胞以1-3×106的密度接种到培养容器中；

4、(2)将非nk的自体pbmc细胞以0.5-2×107浓度置于培养容器中；

5、(3)使用20-40gy的剂量辐照(2)中的非nk的自体pbmc细胞20-40分钟；

6、(4)将(3)中获得的辐照自体pbmc细胞以3-5×106的密度加入到培养容器中培养；

7、可选地，(5)重复步骤(2)-(4)2-5次。

8、优选地，步骤(1)中nk细胞接种密度为2×106；步骤(2)中非nk的自体pbmc细胞密度为1×107；步骤(3)中辐照剂量为30gy，辐照时间为30分钟；步骤(4)中，辐照自体pbmc细胞以5×106的密度加入。

9、此外，本发明还涉及辐照pbmc处理在nk细胞扩增培养中的应用。优选地，辐照pbmc处理是以20-40gy的剂量辐照20-40分钟，更优选地辐照pbmc处理是以30gy的剂量辐照30分钟。

10、发明详述

11、本发明人对滋养层pbmc细胞进行处理试验并分析nk细胞的扩增情况，发现通过滋养层pbmc细胞进行一定剂量的辐照处理，极大提高了nk细胞的扩增效率。

12、因此，本发明人发明了一种辐照pbmc提高nk细胞扩增培养的方法，其包括步骤：

13、(1)将nk细胞以1-3×106的密度接种到培养容器中；

14、(2)将非nk的自体pbmc细胞以0.5-2×107浓度置于培养容器中；

15、(3)使用20-40gy的剂量辐照(2)中的非nk的自体pbmc细胞20-40分钟；

16、(4)将(3)中获得的辐照自体pbmc细胞以3-5×106的密度加入到培养容器中培养；

17、可选地，(5)重复步骤(2)-(4)2-5次。重复辐照并加入非nk的自体pbmc步骤不是必须的，本领域技术人员可以根据具体的nk细胞扩增培养情况确定是否重复辐照并加入非nk的自体pbmc步骤，以及重复辐照并加入非nk的自体pbmc的间隔时间。本发明后附实施例中仅示例性地在day7重复辐照并加入非nk的自体pbmc一次。

18、并且发明人进一步地发现了具备最优效果的参数，例如步骤(1)中nk细胞接种密度为2×106；步骤(1)中非nk的自体pbmc细胞密度为1×107；步骤(3)中辐照剂量为30gy，辐照时间为30分钟；步骤(4)中，辐照自体pbmc细胞以5×106的密度加入。

19、因此，在本发明中，辐照pbmc处理可以应用于nk细胞扩增培养中，并能够提高nk细胞的扩增效率。优选地，辐照pbmc处理是以20-40gy的剂量辐照20-40分钟，更优选地辐照pbmc处理是以30gy的剂量辐照30分钟。

20、在本发明中，培养容器是本领域众所周知的，例如培养瓶、培养皿、细胞培养袋等。在本发明中具体实施方案中，使用了t75培养瓶。

21、在本发明中，非nk的自体pbmc细胞是指t细胞、b细胞以及单核细胞。

22、在本发明中，辐照是指用辐射照射的方法对被辐照物进行处理，一般是指利用放射源的辐射进行照射，具体的辐照步骤按照辐照设备的说明书进行即可。

23、与现有技术相比，本发明方法的有益效果为经过辐照处理自体pbmc细胞后，nk细胞的扩增效率提高10倍左右，14-17天扩增1000倍左右，并且本发明方法具有批间稳定性且纯度高的优势，可以用于后续的治疗等应用。

技术特征：

1.一种辐照pbmc提高nk细胞扩增培养的方法，其包括步骤：

2.权利要求1所述的方法，其中：

3.权利要求1所述的方法，其中：

4.权利要求1所述的方法，其中：

5.权利要求1-4所述的方法，其中：

6.辐照pbmc处理在nk细胞扩增培养中的应用。

7.权利要求6所述的应用，其中辐照pbmc处理是以20-40gy的剂量辐照20-40分钟。

8.权利要求7所述的应用，其中辐照pbmc处理是以30gy的剂量辐照30分钟。

技术总结本发明属于本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种通过辐照PBMC滋养层细胞提高NK细胞扩增培养的方法。本发明方法通过将非NK自体PBMC滋养层细胞进行20‑40Gy的剂量辐照后，NK细胞的扩增效率提高10倍左右，14‑17天扩增1000倍左右，并且本发明方法具有批间稳定性且纯度高的优势，可以用于后续的治疗等应用。技术研发人员：代东发,李琦,杨亚亚,王雪丰受保护的技术使用者：亦诺兴创（北京）生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/29