马赛类芽孢杆菌YT23在PPD型人参皂苷转化中的应用

本技术涉及主人参皂苷的生物转化领域。具体涉及高效人参皂苷转化细菌马赛类芽孢杆菌yt23将ppd型人参皂苷rb1、rb2、rc、rd转化为稀有人参皂苷f2。

背景技术：

1、人参皂苷是人参属植物中具有药用价值的主要次生代谢产物，已有180余种被发现，50余种被分离。其基本结构是由皂苷元骨架和糖基通过糖苷键相连，属于三萜类糖基化合物。根据皂苷元骨架的不同，可分为四环三萜达玛烷型和五环三萜齐墩果烷型。达玛烷型根据四环母核的c-6是否被取代又可分为原人参三醇型(ppt)和原人参二醇型(ppd)。原人参二醇型根据c-3和c-20位上所连接糖基类型和数目的不同，分为rb1、rb2、rc、rd、rg3、rh2、f2等，原人参三醇型分为re、rg1、rg2、rh1、f1等。人参皂苷是人参属植物发挥药效的主要物质基础，具有广泛的药理活性，如具有调节机体免疫系统、抗癌、抗衰老、抗中枢神经系统紊乱等。

2、人参皂苷根据其在人参中的含量多少可分为主要人参皂苷(rb1、rb2、rc、rd、re、rg1等)和稀有人参皂苷(rg2、rg3、rh1、rh2、ck等)。由于人体小肠对植物化学成分的吸收和利用有限，所以相对于主要人参皂苷，具有更短糖链的稀有人参皂苷具有更好的胃肠道吸收率，显现出更高的生物利用度，同时生物活性更高，疗效更佳显著。但稀有人参皂苷含量少、难以提取，且由于人肠道菌群差异性，将近20％的人不能吸收利用人参皂苷。因此，在离体条件下将主要人参皂苷转化为稀有人参皂苷有着重大的意义。

3、本发明从人参根际土壤样品中分离出一株高效人参皂苷转化菌，通过菌种鉴定和转化特性的研究，发现该菌株可选择性高效快速的转化ppd型人参主皂苷(rb1、rb2、rc、rd)为稀有人参皂苷f2,其转化底物多、产物一致，使得目标产物便于提纯，适用于人参皂苷f2单体的制备生产。

技术实现思路

1、本发明目的是提供一株高效的人参皂苷转化菌株——马赛类芽孢杆菌yt23及其在ppd型人参皂苷转化中的应用。

2、本发明采用的技术方案是：

3、马赛类芽孢杆菌(paenibacillus messillensis sp.)yt23，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期为2024年04月18日，保藏编号为cctcc m 2024704；该菌株的主要生物学特征为：在牛肉膏蛋白胨(na)固体培养基或lb固体培养基上，生长迅速，菌落小而突起，颜色透明微白，表面光滑，边缘不规则状；革兰氏染色阳性，呈杆状；适宜生长温度30-37℃、适宜生长ph为5-8；可利用葡萄糖、麦芽糖、果糖、鼠李糖、木糖、甘露醇，不能利用乳糖、棉子糖、山梨醇；水解淀粉；of试验为氧化型；明胶试验、mr试验、v-p试验、七叶苷试验、硝酸盐还原试验为阳性；溶菌酶试验、西蒙氏柠檬酸盐试验为阴性。yt23可高效转化ppd型人参主皂苷rb1、rb2、rc、rd为稀有皂苷f2；转化的最适宜温度为30-37℃、适宜生长ph为5-8；该菌株经16s rrna序列分析鉴定为paenibacillusmessillensis属，命名为paenibacillus messillensis sp.yt23。

4、本发明还涉及所述的马赛类芽孢杆菌(paenibacillus messillensis sp.)yt23在ppd型人参皂苷生物转化中的应用。所述的应用为：将马赛类芽孢杆菌(paenibacillusmessillensis sp.)yt23经培养并离心，制得yt23浓缩菌液；然后与ppd型主要人参皂苷rb1、rb2、rc、rd或含有rb1、rb2、rc、rd的人参皂苷原料为底物混合发酵，将rb1、rb2、rc、rd转化为稀有人参皂苷f2。

5、所述yt23在人参皂苷生物转化中的应用按如下步骤操作：

6、(1)平板培养：将菌株yt23接种于na平板培养基，30-40℃培养24-48h，获得菌体。

7、(2)种子培养：从步骤(1)平板上挑取菌体接种至lb或nb液体培养基中，于30-37℃、ph5-8培养8-24h，制得yt23种子液。

8、(3)扩大培养：将步骤(2)获得的种子液以体积浓度2-5％的接种量接种至lb或nb液体培养基中，于30-37℃、ph5-8培养8-24h，制得yt23培养液。

9、(4)菌液浓缩：将步骤(3)获得的培养液在转速6000r/min的离心机中离心5min，弃上清，获得浓缩10-50倍的菌液，用于ppd型主要人参皂苷rb1、rb2、rc、rd的发酵转化。

10、(5)发酵转化：将ppd型主要人参皂苷rb1、rb2、rc、rd或含有rb1、rb2、rc、rd的人参皂苷原料与步骤(4)的yt23浓缩菌液均匀混合，与30-37℃、ph5-8发酵转化24-72h,将ppd型主要人参皂苷rb1、rb2、rc、rd转化为人参皂苷f2。

11、所述的主要人参皂苷rb1、rb2、rc、rd或为含有rb1、rb2、rc、rd的人参皂苷原料与yt23浓缩10-50倍菌液混合的发酵液中，初始主要人参皂苷rb1、rb2、rc、rd含量为0.01-10％(按质量计)，初始yt23菌体浓度为6×107-1×108个/ml。

12、所述人参皂苷原料为含有rb1、rb2、rc、rd的天然药材原料或含有rb1、rb2、rc、rd的天然人参皂苷提取物；所述含有rb1、rb2、rc、rd的天然药材原料包含人参、西洋参、三七中的一种或多种混合物；所述含有rb1、rb2、rc、rd的天然人参皂苷提取物包括人参提取物、三七提取物、西洋参提取物中的一种或多种混合物；人参、西洋参、三七的茎、叶也可作为本发明发酵原料。

13、作为优选，所述yt23在人参皂苷生物转化中的应用按如下步骤操作：

14、(1)平板培养：将菌株yt23接种于na平板培养基，37℃培养36h，获得菌体。

15、(2)种子培养：从步骤(1)平板上挑取菌体接种至lb液体培养基中，于30℃、ph7培养12h，制得yt23种子液。

16、(3)扩大培养：将步骤(2)获得的种子液以体积浓度4％的接种量接种至lb液体培养基中，于30℃、ph5.5培养12h，制得yt23培养液。

17、(4)菌液浓缩：将步骤(3)获得的培养液在转速6000r/min的离心机中离心5min，弃上清，获得浓缩25倍的菌液，用于ppd型主要人参皂苷rb1、rb2、rc、rd的发酵转化。

18、(5)发酵转化：将ppd型主要人参皂苷rb1、rb2、rc、rd或含有rb1、rb2、rc、rd的人参皂苷原料与步骤(4)的yt23浓缩菌液均匀混合，与35℃、ph5.5发酵转化24h,将ppd型主要人参皂苷rb1、rb2、rc、rd转化为人参皂苷f2。

19、本发明发酵液经常规技术去除菌体、杂质后可获得稀有人参皂苷f2粗提物，也可经常规方法提取提纯获得高纯度目标产物稀有人参皂苷f2。

20、与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明所述(paenibacillusmessillensis sp.)yt23培养发酵工艺简单，成本低廉；突出体现在菌株yt23可选择性高效转化ppd型主要人参皂苷rb1、rb2、rc、rd为稀有人参皂苷f2，底物更加广泛，目标产物一致，便于提取；所需发酵转化时间短(12-24h)，转化速度远大于现有技术(3-7d),可大幅提高生产效率，具有很好的应用前景。