一种松材线虫RPA-Exo检测的引物探针组合、检测方法及应用与流程

本发明涉及生物检测，特别是涉及一种松材线虫rpa-exo检测的引物探针组合、检测方法及应用。

背景技术：

1、松材线虫(bursaphelenchus xylophilus)是全球森林生态系统中最具毁灭性的有害生物之一，由其引起松树萎蔫病。松材线虫的传播扩散主要是包括通信、电力、交通等工程建设运输过程中人为因素造成的，直接砍掉疫木以阻断传播途径是目前最有效的防治措施。实现病原的有效、快速、准确检测，可以从根源上控制病害的扩散蔓延，因此松材线虫病防治的首要工作就是做好病原的检测与鉴定。

2、传统的松材线虫形态学检测是最基本、最经济的鉴定方法，不用依赖昂贵的仪器和设备，但其在应用过程中存在着缺陷，最主要的问题在于，难于与松材线虫同属的其它伞滑刃线虫区分，特别是与拟松材线虫的区别难度最大。松材线虫与拟松材线虫雌成虫的尾尖突和尾形、雄虫的交合刺形态在种间也有部分重叠现象，检测上容易造成错判。此外，形态学鉴定对线虫不同虫态也有一定要求，局限于成虫，不适用于幼虫，检疫过程还需要人工培养成虫，费时费力，为快速检疫带来很大困难。

3、随着分子诊断技术的发展，一线工作人员越来越追求对病原实时实地的快速、便捷检测。pcr作为一种具有划时代意义的核酸检测方法，在分子诊断领域中被广泛应用。但该方法对使用人员的分子生物学技术要求较高，需要一定的实验操作基础和数据分析技能，且通常需要在严格控制的实验室环境下进行，对设备依赖性较高。核酸等温扩增技术被称为pcr的替代品，克服了传统基于pcr的检测技术手段对变温设备的依赖，仅需要等温条件便可实现对靶序列的高敏扩增。近年来，等温扩增技术在植物线虫领域的应用研究也受到越来越多的关注。在松材线虫检测方面，环介导等温扩增技术(lamp)应用最为广泛。除了lamp技术以外，其它种类的等温扩增技术在该领域也有应用。重组酶聚合酶扩增(recombinase polymeraseamplification，rpa)作为近年来发展最快的等温扩增技术，已用于象耳豆根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、南方根结线虫、北方根结线虫以及菊花滑刃线虫等多种植物线虫快速检测。

4、尽管之前已有针对松材线虫dna检测的rpa-basic和rpa-lfd的研发，但由于终点检测依赖实验室内制作程序复杂的凝胶电泳或者一次性侧流层析试纸条耗材，不便于野外现场检测或者检测所需一次性耗材成本较高。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种松材线虫rpa-exo检测的引物探针组合、检测方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明建立的松材线虫rpa-exo检测方法具有良好的特异性和敏感性，最低检测限为1pg/μl(10-3ng/μl)，在39℃条件下等温扩增20min即可完成对松材线虫的检测。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种用于松材线虫rpa-exo检测的引物探针组合，包括上游引物s1f、下游引物s1r和探针rpa-exo-p，所述上游引物s1f的序列如seq id no.1所示，所述下游引物s1r的序列如seq id no.2所示，所述探针rpa-exo-p的结构为核苷酸片段1-四氢呋喃残基-核苷酸片段2，其中核苷酸片段1的核苷酸序列为seq id no.13，核苷酸片段2的核苷酸序列为seq id no.14，seq id no.13的第30位核苷酸t标记荧光基团，seq id no.14的第3位核苷酸a标记淬灭基团，3’端进行阻断修饰。

4、进一步地，所述荧光基团为fam，所述淬灭基团为bhq1，所述seq id no.14的3’端连接c3-spacer。

5、本发明还提供所述的引物探针组合在制备用于辅助检测松材线虫的产品中的应用。

6、进一步地，所述产品包括rpa-exo检测试剂盒。

7、本发明还提供一种用于松材线虫rpa-exo检测的试剂盒，所述试剂盒含有所述的引物探针组合。

8、本发明还提供所述的引物探针组合或所述的试剂盒在辅助检测松材线虫中的应用。

9、本发明还提供一种松材线虫rpa-exo检测的方法，包括以待测样本的dna为模板，用所述的引物探针组合或所述的试剂盒进行rpa-exo检测，获得荧光值；根据所述荧光值确定待测样本是否含有松材线虫。

10、进一步地，所述待测样本的dna提取方法为chelex-100法。

11、进一步地，所述rpa-exo检测的反应体系包括2μl上游引物s1f、2μl下游引物s1r、0.6μl探针rpa-exo-p、8.5μl ddh2o和5μldna；所述上游引物s1f、所述下游引物s1r和所述探针rpa-exo-p的浓度均为10μm。

12、进一步地，所述rpa-exo检测的反应条件为39℃，20min。

13、本发明公开了以下技术效果：

14、本发明以编码syg-2(synaptic guidepost protein 2)的保守基因syg2作为靶标，设计并筛选出了一组可用于松材线虫rpa-exo检测的最佳引物探针组合，并在此基础上建立了松材线虫rpa-exo检测方法，该方法具有良好的特异性和敏感性，最低检测限为1pg/μl(10-3ng/μl)；在39℃条件下等温扩增20min即可完成对松材线虫的检测。整个过程操作简单，是一种快速诊断松材线虫的有效手段。

15、本发明以chelex-100核酸快速提取方法从12份感病松木样本中提取的dna，并采用上述筛选的最佳引物探针组合进行rpa-exo扩增，最终rpa-exo法成功检测到12个感病松木样本，并与pcr扩增鉴定结果一致，准确率达100％。整个检测过程从dna提取到扩增读取结果，只要40min左右，具有一定的野外即时检测应用潜力。

技术特征：

1.一种用于松材线虫rpa-exo检测的引物探针组合，其特征在于，包括上游引物s1f、下游引物s1r和探针rpa-exo-p，所述上游引物s1f的序列如seq id no.1所示，所述下游引物s1r的序列如seq id no.2所示，所述探针rpa-exo-p的结构为核苷酸片段1-四氢呋喃残基-核苷酸片段2，其中核苷酸片段1的核苷酸序列为seq id no.13，核苷酸片段2的核苷酸序列为seq id no.14，seq id no.13的第30位核苷酸t标记荧光基团，seq id no.14的第3位核苷酸a标记淬灭基团，3’端进行阻断修饰。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述荧光基团为fam，所述淬灭基团为bhq1，所述seq id no.14的3’端连接c3-spacer。

3.如权利要求1或2所述的引物探针组合在制备用于辅助检测松材线虫的产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括rpa-exo检测试剂盒。

5.一种用于松材线虫rpa-exo检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1或2所述的引物探针组合。

6.如权利要求1或2所述的引物探针组合或权利要求5所述的试剂盒在辅助检测松材线虫中的应用。

7.一种松材线虫rpa-exo检测的方法，其特征在于，包括以待测样本的dna为模板，用权利要求1或2所述的引物探针组合或权利要求5所述的试剂盒进行rpa-exo检测，获得荧光值；根据所述荧光值确定待测样本是否含有松材线虫。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述待测样本的dna提取方法为chelex-100法。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述rpa-exo检测的反应体系包括2μl上游引物s1f、2μl下游引物s1r、0.6μl探针rpa-exo-p、8.5μl ddh2o和5μl dna；所述上游引物s1f、所述下游引物s1r和所述探针rpa-exo-p的浓度均为10μm。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述rpa-exo检测的反应条件为39℃，20min。

技术总结本发明公开了一种松材线虫RPA‑Exo检测的引物探针组合、检测方法及应用，属于生物检测技术领域。本发明以基因Syg2作为靶标进行引物和探针的设计，从6对引物中筛选出了扩增效果最佳的1组引物，并对反应温度进行了优化，建立了以syg2基因为靶标的松材线虫RPA‑Exo快速检测方法。该方法具有良好的特异性和敏感性，最低检测限为1pg(10<supgt;‑3</supgt;ng)；在39℃条件下等温扩增20min即可完成对松材线虫的检测。以Chelex‑100核酸快速提取方法从12份感病松木样本中提取的DNA，并采用上述筛选的最佳引物探针组合进行RPA‑Exo扩增，只要40min左右，准确率高，具有一定的野外即时检测应用潜力。技术研发人员：吕全,王慧敏,吴啸林,窦桂铭受保护的技术使用者：中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所（国家林业和草原局世界自然遗产保护研究中心）技术研发日：技术公布日：2024/9/29