一种基于KASP技术检测反枝苋对氟磺胺草醚靶标抗性的引物组合及其应用

本发明属于植物保护，涉及一种农田杂草的抗药性快速检测方法；用于快速检测大豆玉米田反枝苋对氟磺胺草醚的抗药性，针对ppo2上128位氨基酸突变所介导的靶标抗性。

背景技术：

1、反枝苋(amaranthus retroflexus l.)是大豆田和玉米田常见恶性杂草，别名西风谷、野苋菜、人苋菜，一年生草本，雌雄同株，自花授粉，染色体2n＝34。反枝苋原产于北美洲，于1905年入侵我国，目前基本各省市均有分布。反枝苋适应性较强，可随作物种子、水流、风、有机肥、牲畜粪便以及鸟类等进行传播。反枝苋作为一种农田杂草，与作物竞争光和水肥，侵占作物的生长空间；以呼伦贝尔为例，2019年反枝苋发生面积为26.76hm2，成害面积9.33hm2，造成作物减产。东北是我国大豆和玉米的主产区，而反枝苋是大豆、玉米等旱田发生严重的常见杂草。氟磺胺草醚和噻吩磺隆分别是大豆和玉米田防除反枝苋的常见除草剂。

2、氟磺胺草醚，由英国iciplant protection division公司推出的一种二苯醚类(diphenylethers)除草剂。1998年浙江嘉华化工有限公司在我国登记了氟磺胺草醚水剂并投入生产使用，主要用于花生、玉米、大豆等旱田作物防除阔叶类杂草，同时对于禾本科杂草也具有一定的抑制作用。氟磺胺草醚的作用靶标为原卟啉原氧化酶(protoporphyrinogen ix oxidase，ppo)，ppo是四吡咯生物合成途径中高度保守的膜结合酶家族，是叶绿素和血红素生物合成的关键酶，原卟啉原ix氧化酶由核基因编码，具有两种亚型，分别是ppo1和ppo2；其中ppo1由ppx1编码，位于叶绿体膜上；ppo2由ppx2编码，位于线粒体膜上。在一些原核生物和植物中，ppx2可以双重靶向叶绿体和线粒体。以二苯醚类为代表的ppo抑制剂凭借杀草谱广、药效高、作用速度快、低毒、土壤残留期短等优点而被广泛使用。

3、随着除草剂的大量单一使用，杂草种群在除草剂的选择压下不断被筛选，进化出了抗药性。杂草对除草剂产生抗药性的机制分为靶标位点抗性(target site resistance，tsr)和非靶标位点抗性(non-target site resistance，ntsr)机制。靶标位点抗性主要是由于杂草体内靶标酶基因发生突变，导致靶标酶对药剂的敏感性下降，或者靶标酶的过量表达。非靶标位点抗性通过多种基因调控杂草生理代谢过程，使杂草产生抗性。相对于靶标抗性，非靶标抗性的机理更为复杂，已经报道过的便有杂草对除草剂的解毒作用增强、除草剂对抗性生物型的渗透作用减弱、抗性种群对除草剂的吸收减少、除草剂在抗性种群体内传导变慢等多个方面。截至2023年，除草剂抗性行动委员会统计报道了全球范围内15种杂草(双子叶杂草11种，单子叶杂草4种)对ppo抑制剂类除草剂产生抗性；而多达172种杂草(双子叶杂草105种，单子叶杂草67种)对als抑制剂类除草剂产生抗性。现已发现多种靶标位点突变赋予杂草对ppo抑制剂类除草剂的抗性，包括ppo2中gly-210氨基酸缺失，ppo2中arg-128-gly/met、gly-399-ala和val-361-ala氨基酸取代，以及ppo1中ala-212-thr的取代。

4、目前一般使用整株生物测定法对反枝苋的抗性情况进行测定，整株生物测定法：首先收集疑似抗药性的杂草生物型并从未使用过除草剂的田块采集杂草种子作为敏感种群，在温室内进行盆栽法实验，在播后苗前或者苗后进行常规施药处理。药剂设置成不同浓度梯度，通过测定不同剂量下杂草的出苗率、死亡率、叶面积、鲜重或干重等指标，以确定杂草抗药性信息。这种方法无法确定抗药性产生的机理与抗药性机制等问题，且需要耗费大量时长，往往要等到杂草种子成熟后才能确定抗性水平，在农业生产上会错失防治最佳时期。因此急需一种方法能够在当季对杂草的抗性情况进行测定，以便能够在当季对抗性杂草进行精准化学防除，减轻草害发生，降低损失。

5、竞争性等位基因pcr(kompetitive allele-specific pcr，kasp)是一项基于荧光检测的独特的竞争性等位基因特异性pcr技术，可对各种基因组核酸样品进行单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)和插入缺失(insertion and deletion，indel)高精度双等位基因分型，技术操作简单，分析稳定准确，并且成本较低，易于实现高通量和自动化。该技术最早主要被应用于snp或indel基因分型研究中，目前正逐渐成为分子辅助育种、性状基因的精细定位以及种子资源鉴定的主要技术手段。该技术建立于碱基互补配对原则，在pcr扩增的过程中，引物与模板结合时，末尾碱基与模板链不同的引物与模板链的结合速率会显著低于末尾碱基与模板链相同的引物，同时在两个末尾碱基不同的正向引物的5’端各自增添了特异性的荧光基因序列，因此在pcr扩增时，与模板链末尾碱基相同的引物会更好地与模板链结合扩增，从而会发出更强的特定荧光信号，我们就可以以此来判断模板链的特定碱基是何种碱基，由此推导其是否产生了抗性。

6、目前已经报道了多种靶标位点突变赋予反枝苋对氟磺胺草醚(ppo抑制剂类除草剂)的抗药性。2020年，王豪在其硕士毕业论文中通过对抗氟磺胺草醚的反枝苋进行研究，首次揭示了反枝苋ppo2上arg-128-gly的突变与其对ppo抑制剂类除草剂(氟磺胺草醚)的抗性之间的直接关联。同年，huang等人也验证了这一发现，揭示了ppo2上arg-128-gly突变如何导致反枝苋对氟磺胺草醚产生抗药性。随后，在2021年，中国农科院植保所在weedscience期刊上发表了论文，进一步确认了反枝苋ppo2上的arg-128-gly突变是导致其对氟磺胺草醚产生抗性的关键因素之一。到了2023年，吴群等使用整株生物测定法对抗氟磺胺草醚的反枝苋种群进行了研究，并对其机制进行了探究，再次验证了ppo2上arg-128-gly突变是反枝苋对氟磺胺草醚产生抗性的主要原因。综上所述，ppo2上arg-128-gly的突变已被广泛认为是反枝苋对氟磺胺草醚产生抗性的主要原因之一。本发明针对反枝苋ppo2中的arg-128-gly氨基酸取代，进行kasp标记鉴定体系开发，用于鉴定反枝苋是否发生该类型的靶标突变并导致抗药性的产生；该方法可以缩短发现抗药性的时间，避免药剂滥用导致的抗药性发展等问题，以期能在最佳的防治时间，选择适当的除草剂对反枝苋进行化学防治，减轻草害的发生，提升作物品质与产量。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于kasp技术检测反枝苋对氟磺胺草醚靶标抗性的引物组合及其应用。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

3、第一方面，本发明请求保护一种基于kasp技术检测反枝苋对氟磺胺草醚抗性的引物组合物，该引物组合物包括如seq id no.1所示的带有hex荧光接头的特异性正向引物hex-f、如seq id no.2所示的带有fam荧光接头的特异性正向引物fam-f和如seq id no.3所示的通用反向引物com-r。

4、本发明基于反枝苋ppo2基因上128位氨基酸所对应的arg-128-gly氨基酸取代(碱基突变为：agg突变为ggg)设计的三条引物，包括两条正向引物和一条反向引物。在末尾碱基为突变碱基(加粗和下划线)的正向引物的5’端加上了fam荧光接头序列(下划线)，而在末尾碱基为未突变碱基(加粗和下划线)的正向引物的5’端加上了hex的荧光接头序列(下划线)。

5、所述的带有hex荧光接头的特异性正向引物(hex-f)：

6、

7、所述的带有fam荧光接头的特异性正向引物(fam-f)：

8、

9、通用反向引物(com-r)：ggtagtagcaccggaagaccat(seq id no.3)

10、第二方面，本发明请求保护上述的引物组合物在检测反枝苋对氟磺胺草醚抗性中的应用。

11、第三方面，本发明请求保护上述的引物组合物在制备用于检测反枝苋对氟磺胺草醚抗性的试剂盒中的应用。

12、第四方面，本发明请求保护一种基于kasp技术检测反枝苋对氟磺胺草醚靶标抗性的试剂盒，该试剂盒中包含上述的引物组合物。

13、第五方面，本发明请求保护一种用于检测反枝苋对氟磺胺草醚靶标抗性的方法，采用上述的试剂盒以待测反枝苋样品的cdna为模板进行pcr扩增，扩增结束进行产物荧光扫描，根据荧光强度来判断反枝苋样品是否对氟磺胺草醚产生抗药性；

14、如果检测出fam强荧光且无有效hex荧光，所测的cdna样品为纯合的突变体，反枝苋样品对氟磺胺草醚产生抗药性；

15、如果检测出hex强荧光且无有效fam荧光，所测的cdna样品为纯合的未突变体，反枝苋样品对氟磺胺草醚敏感；

16、如果同时检测出fam和hex强荧光，所测的cdna样品为杂合突变体，反枝苋样品对氟磺胺草醚产生抗药性。

17、本发明由于两条正向引物末尾碱基的不同，在扩增过程中两条不同的引物会寻找相应的模板链进行扩增，两条不同引物的前端各自增加了一段特殊的荧光接头序列(与试剂中hex和fam荧光探针上的序列一致)，在扩增结束进行产物荧光扫描时，相应的引物和模板的扩增产物会被检测出相应的荧光强度，可以依据pcr产物不同的荧光强度来判断所测的反枝苋样品是否对氟磺胺草醚产生了抗药性(如图1)。

18、本发明的有益效果：

19、(1)快速性：传统的基于整株生物测定法的杂草抗药性检测技术需要在田间采集到疑似抗性种群的反枝苋种子，然后再在实验室中进行培养，整体耗时在两个月至三个月，且需要耗费大量的人力物力；而本专利采用的kasp技术，只需在田间采取疑似抗性反枝苋的叶片组织样品，送到实验室后进行rna的提取、反转录以及进行pcr荧光检测，整体检测时间大约在6个小时，显著缩短了检测时间。该技术直接针对特定基因位点进行精确检测，能够在6个小时内得出结果，及时完成除草剂的精准选药，以防除反枝苋。

20、(2)准确性：通过设计针对ppo2上128位氨基酸突变的特异性引物组合，本技术能够高度准确地检测反枝苋是否对氟磺胺草醚产生了抗药性。这种准确性对于精准选用除草剂至关重要。

21、(3)高通量：kasp技术易于实现高通量检测，能够在96孔板同时检测大量样本，从而极大提高检测效率。这对于大面积多点农田中反枝苋对氟磺胺草醚抗药性的快速筛查具有重要意义。

22、(4)环保与可持续性：精准检测反枝苋的抗药性，可以避免因过量或不合理使用除草剂而导致的环境污染和生态破坏，有助于推动农业的可持续绿色发展。

23、(5)适应性广：本专利的kasp技术不仅适用于检测反枝苋对氟磺胺草醚的抗药性，还有望扩展到其它杂草对除草剂的抗性检测中，展现出较广泛的通用性和适应性。

24、综上所述，本专利提供的基于kasp技术的反枝苋对氟磺胺草醚靶标抗性检测引物组合及其应用，具有快速、准确、高通量、环保可持续和广泛适应性等显著优势。这些优势使其在农田杂草防除中具有重要的田间应用价值。