核黄素合成酶基因OsRIBAB2调控水稻耐盐和耐旱性的应用

本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及水稻核黄素合成酶基因osribab2及其负调控耐盐和耐旱性的应用。

背景技术：

1、

2、作为固着生物，植物必须适应土壤盐碱害、干旱以及极端温度等非生物胁迫。盐主要引起植物遭受渗透胁迫和离子毒害，而干旱则主要使植物遭受渗透胁迫。二者对植物带来的次级影响较为复杂，包括导致氧化损伤、破坏膜脂、蛋白质和核酸等细胞组分，并引起代谢紊乱。

3、土壤中盐分浓度的增加不仅会减少水分吸收，还会导致水稻吸收大量的na+和cl-，从而导致渗透和离子胁迫(deinlein,et al.plant salt-tolerance mechanisms.trendsplant sci.2014,19,371–379)。水稻减少水分流失，同时最大限度地吸收水分，以缓解渗透胁迫。通过积累调节渗透压的物质来降低细胞质水势是保护水稻免受盐胁迫的基本策略(reddy,et al.salt tolerance in rice:focus on mechanisms and approaches.ricesci.2017,24,123–144)。在高盐条件下，水稻可快速诱导编码调渗物质产生酶的基因，导致细胞内调节渗透压的物质积累，水势下降，从而增强水稻对盐胁迫的耐受性(li,etal.overexpression of the trehalose-6-phosphate synthase gene ostps1 enhancesabiotic stress tolerance in rice.planta,2011,234,1007–1018)。另外，水稻通过转运体控制根系和茎部细胞的质膜和液泡膜对na+的净摄取，以减少细胞质和细胞器的离子毒性，其中最经典的一个通路就是sos(salt-overly-sensitivity)途径。sos途径最开始在拟南芥中被发现，后来在水稻中被证明存在同样的信号通路来调控盐胁迫耐受性。该途径主要由sos1、sos2和sos3为核心组成，通过响应ca2+和磷酸化修饰来调控k+和na+的转运(martinez-atienza,et al.conservation of the salt overly sensitive pathway inrice.plant physiol.2007,143,1001–1012)。

4、干旱胁迫的一个标志是脱落酸(aba)的积累，它引起了几种保护性反应，包括气孔的关闭和胁迫应答基因的诱导(caine,et al.rice with reduced stomatal densityconserves water and has improved drought tolerance under future climateconditions.new phytol.2019,221,371–384)。许多证据表明气孔的打开和关闭与植物耐旱密切关联：在水分充足的条件下，气孔对光的响应使co2进入叶片进行光合作用，水分通过蒸腾作用蒸发，从而调节叶片温度；在缺水干旱条件下，气孔关闭以减缓水分流失，从而提高生存和水分利用效率(chen,et al.protein kinases in plant responses todrought,salt,and cold stress.j.integr.plant biol.2021,63,53–78)。aba在干旱胁迫下调节植物气孔运动以减少蒸腾作用中起着关键作用，因此许多关于干旱胁迫的研究都集中在aba信号传导上，尤其是对aba受体的研究。pyr1和pyl蛋白家族在拟南芥和水稻中作为aba受体发挥作用，ospyl1、ospyl6和ospyl12组合突变使水稻不耐旱(miao,etal.mutations in a subfamily of abscisic acid receptor genes promote ricegrowth and productivity.proc.natl.acad.sci.usa.2018,115,6058–6063)；过表达ospyl3、ospyl5、ospyl9和ospyl11使水稻耐旱(kim,et al.overexpression ofpyl5 inrice enhances drought tolerance,inhibits growth,and modulates geneexpression.j.exp bot.2014,65,453–464；tian,et al.characterization andfunctional analysis of pyrabactin resistance-like abscisic acid receptorfamily in rice.rice,2015,8,28)。除aba外，越来越多的证据表明，h2o2在干旱胁迫下水稻气孔关闭中发挥着关键作用，其作用方式包括aba依赖和aba不依赖。osasr5就是通过与aba和h2o2信号相关的气孔关闭途径促进干旱耐受性(li,et al.osasr5 enhances droughttolerance through a stomatal closure pathway associated with abaandh2o2signalling in rice.plant biotechnol.j.2017,15,183–196)，而dst和ossro1则只通过调节h2o2的积累来调控水稻气孔闭合，而不依赖于aba(you,et al.the snac1-targetedgene ossro1c modulates stomatal closure and oxidative stress tolerance byregulating hydrogen peroxide in rice.j.exp.bot.2013,64,569–583)。

5、核黄素(riboflavin)的从头合成存在于植物、真菌、古细菌和众多细菌中，而动物则依赖于饮食供应(bacher,et al.biosynthesis of vitamin b2(riboflavin).annu.rev.nutr.2000,20:153-167)。核黄素是黄素单核苷酸(fmn)和黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)的合成前体，黄素单核苷酸(fmn)和黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)是参与单电子和双电子氧化还原过程的多种酶(如脱氢酶、氧化酶、还原酶)的必需辅因子。对于所有生物中的主要代谢途径至关重要。在植物中，这些辅因子是光合作用、线粒体电子运输、脂肪酸氧化、光接收、dna修复、其他辅因子的代谢以及许多次生代谢产物生物合成所必需的(fischer andbacher.biosynthesis of vitamin b2:structure and mechanism of riboflavin synthase.arch.biochem.biophys.2008,474:252-265；ouyang,et al.the photosensitivephs1 mutant is impaired in the riboflavin biogenesis pathway.j.plantphysiol.2010,167:1466-1476)。核黄素在植物生长发育中的作用已有报道，比如核黄素能保护植物避免光氧化损伤(hedtke,et al.deficiency in riboflavin biosynthesisaffects tetrapyrrole biosynthesis in etiolated arabidopsis tissue.plantmol.biol.2012,78,77–93)、能维持活性氧的平衡和叶绿体的正常发育(hu,et al.whiteand lesion-mimic leaf1,encoding a lumazine synthase,affects reactive oxygenspecies balance and chloroplast development in rice.plant j.2021,108:1690-1703)，以及协同线粒体能量代谢和细胞周期来调控胚乳发育(tian,et al.riboflavinintegrates cellular energetics and cell cycle to regulate maize seeddevelopment.plant biotechnol.j.2022,20:1487-1501)。

6、尽管核黄素在植物生长过程中发挥重要作用，但关于其在非生物胁迫中的作用却知之甚少。前期我们通过图位克隆技术，从响应高温的水稻分蘖突变体tsm1中鉴定到核黄素合成关键酶基因osribab2(周正琨.高温寡分蘖水稻突变体tsm1的基因定位与功能分析.湖南大学,2021)。我们最近发现，osribab2编码蛋白具有2个酶活性结构域：一个是位于n端的3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合成酶(dhbps)活性域；另一个是位于c端的gtp环化水解酶ii(gchii)活性域。osribab2中的2个结构域的酶活性控制着生物体内核黄素合成途径的关键起始反应。其部分功能缺失(gchii缺失)突变体tsm1显著提高了水稻耐盐性和耐旱性。因此，可以通过生物技术利用osribab2培育耐盐性和耐旱性改良的水稻材料。

技术实现思路

1、本发明提供一种水稻核黄素合成酶蛋白编码基因osribab2，该基因负调控水稻的耐盐性和耐旱性。盐和干旱处理后，osribab2部分功能缺失(gchii缺失)的tsm1植株体内超氧化物岐化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)的酶活性均要高于野生型(wt)，体内最终的过氧化氢(h2o2)含量要显著低于wt，其它一些与耐逆正相关的指标如脯氨酸、可溶性糖以及叶绿素的含量均要高于wt，而与耐逆负相关的指标如丙二醛(mda)含量和相对离子渗透率均要低于wt。这些结果表明osribab2基因在水稻耐盐和耐旱品种培育具有重要的应用价值。本发明中负调控水稻耐盐和耐旱性的基因osribab2为培育耐盐和耐旱水稻方面具有重要的应用价值。

2、本发明所提供的水稻核黄素合成酶蛋白，名称为osribab2，来源于水稻(oryzasativa l.)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

3、1)序列表中的seq id no:3；

4、2)将序列表中seq id no:3的氨基酸残基序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控水稻耐盐和耐旱功能的蛋白质。

5、序列表中的序列3由554个氨基酸残基组成。

6、osribab2的编码基因也属于本发明的保护范围。

7、osribab2基因的cdna，可具有下述核苷酸序列之一：

8、1)序列表中seq id no:2的dna序列；

9、2)编码序列表中seq id no:3蛋白质序列的多核苷酸；

10、3)在高严谨条件下可与序列表中seq id no:2限定的dna序列杂交的核苷酸序列；

11、4)与序列表中seq id no:2限定的dna序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna序列。

12、序列表中的序列2由1,662个碱基组成，其开放阅读框(orf)为自5′端第1位至1,662位碱基。

13、osribab2的基因组基因，可具有下述核苷酸序列之一：

14、1)序列表中seq id no:1的dna序列；

15、2)编码序列表中seq id no:3蛋白质序列的多核苷酸；

16、3)在高严谨条件下可与序列表中seq id no:1限定的dna序列杂交的核苷酸序列；

17、4)与序列表中seq id no:1限定的dna序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna序列。

18、序列表中的序列1为osribab2的基因组序列，包含了4,949个碱基，该基因含有7个外显子(序列1的5′端起：419～472，871～1266，1353～1575，2261～2582，3039～3169，3280～3575，4320～4559)和6个内含子(序列1的5′端起：473～870，1267～1352，1576～2260，2583～3038，3170～3279，3576～4319)。

19、所述高严谨条件可为在0.1×sspe(或0.1×ss)，0.1×sds的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

20、含有osribab2的表达载体，转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

21、扩增osribab2基因中任一片段的引物也在本发明的保护范围之内。

22、本发明提供所述水稻核黄素合成酶编码基因在培育水稻品种中的应用。具体地，培育耐盐和/或耐旱的水稻品种。

23、进一步地，通过基因工程手段将水稻内源的osribab2基因发生部分功能缺失突变或全部功能丧失的突变。

24、更具体地，所述基因工程手段是基因敲除或基因沉默的转基因技术，具体是基因编辑的方法或rnai技术。

25、进一步具体地，所述基因编辑的方法或rnai技术是针对水稻核黄素合成酶编码基因中的15个或15个以上连续碱基的寡核苷酸作为靶标来设计sgrna或sirna，使基因功能失活，从而使转基因水稻具有耐盐性和耐旱性。

26、本发明具有以下有益效果：

27、osribab2在水稻盐和干旱胁迫响应中发挥重要的作用，负调控水稻耐盐性和耐旱性。实验证明，140mm nacl和20％peg处理下，osribab2部分功能缺失(gchii缺失)的tsm1突变植株体内sod、cat的酶活性均要高于wt，体内最终的h2o2含量要显著低于wt，其它一些与耐逆正相关的指标如脯氨酸、可溶性糖以及叶绿素的含量均要高于wt，而与耐逆负相关的指标如丙二醛(mda)含量和相对离子渗透率均要低于wt。这些结果表明，当osribab2的gchii酶活性域发生突变后，水稻体内的抗氧化系统活性会提高并且清除ros的能力增强，从而提高水稻的耐盐性和耐旱性。后续可以通过基因敲除或基因沉默的转基因技术，利用osribab2基因可以对水稻的耐盐性以及耐旱性进行遗传改良，在农业应用领域具有广阔的应用前景。

28、下面结合具体实施例对本发明做进一步说明