一种具有免疫细胞衔接器功能的工程化外膜囊泡及其制备方法和应用

本发明属于生物医药，具体涉及一种具有免疫细胞衔接器功能的工程化外膜囊泡及其制备方法和应用。

背景技术：

1、肿瘤免疫疗法在治疗多种血液病和实体瘤方面取得了显著的成功。其中，免疫细胞衔接器通过招募和激活肿瘤组织内的免疫细胞，最终导致癌细胞的消灭，成为癌症治疗的有力治疗实体。免疫细胞衔接器通常是指对肿瘤细胞和免疫细胞都具有高亲和力的工程化多特异性抗体，能够桥接肿瘤细胞和免疫细胞并激活免疫细胞。但是，这些传统的基于蛋白的免疫细胞衔接器面临着在体内不稳定、设计复杂和制造昂贵等诸多问题。因此，亟待开发一种新型的免疫细胞衔接器。

2、外膜囊泡(outer membrane vesicles,omvs)是革兰氏阴性菌分泌的天然胞外囊泡，携带着遗传自母菌的lps、脂蛋白、肽聚糖等免疫刺激分子。由于其纳米级尺寸和灵活的可操作性，omvs已成为有价值的药物递送载体，能够在腔内封装多种形式的药物或将其偶联在表面。此外，外膜囊泡天然具有天然佐剂特性，能够吸引免疫细胞和引发免疫反应，能够抑制肿瘤的生长。因此，外膜囊泡是开发新型免疫细胞衔接器的优异候选材料。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的目的在于提供一种具有免疫细胞衔接器功能的工程化外膜囊泡及其制备方法和应用。

2、具体的技术方案如下：

3、本发明的第一目的是在于提供一种具有免疫细胞衔接器功能的工程化外膜囊泡，意在解决传统基于蛋白的免疫细胞衔接器的问题。

4、本发明的第二目的是在于提供一种上述工程化外膜囊泡的制备方法。

5、本发明的第三目的是在于提供上述工程化外膜囊泡作为药物在治疗肿瘤中的应用。

6、第一方面，本发明提供了一种具有免疫细胞衔接器功能的工程化外膜囊泡，其表面表达有spycatcher003蛋白，负载有两种多聚化的纳米抗体。

7、作为进一步技术方案，spycatcher003蛋白与细菌ompa蛋白融合，序列由lpp信号肽引导，融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

8、作为进一步技术方案，所述纳米抗体之一的a4为二聚化并与snoopcatcher和spytag003蛋白融合，融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示,所提供的二聚化的纳米抗体a4，在二聚化后相比单一的纳米抗体具有更强的活性，能够阻断cd47/sirpα免疫检查点。

9、在一个具体的实施方案中，单价、二价和三价纳米抗体a4被偶联在支架外膜囊泡表面后与b16-f10-gfp细胞和巨噬细胞共孵育，结果显示二聚化a4偶联的外膜囊泡处理使巨噬细胞内绿色荧光信号最强，说明二聚化的纳米抗体a4对cd47的阻断活性最强；优选地，所述纳米抗体皆由大肠杆菌异源表达；优选的，所述巨噬细胞为骨髓来源巨噬细胞(bmdms)。

10、作为进一步技术方案，所述纳米抗体之一的5dxw(t61v)为三聚化并与snooptag蛋白融合，融合蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示，所提供的三聚化纳米抗体5dxw(t61v)比单一的纳米抗体具有更强的活性，能够阻断pd-1/pd-l1免疫检查点。

11、在一个具体的实施方案中，单价、二价和三价纳米抗体5dxw(t61v)被偶联在支架外膜囊泡表面后与b16-f10细胞和pbmcs细胞共孵育，结果显示三聚化的5dxw(t61v)偶联的外膜囊泡处理使b16-f10凋亡比例最高，说明三聚化的5dxw(t61v)活性最强；优选地，所述纳米抗体皆由大肠杆菌异源表达；优选的，所述pbmc细胞为外周血单核细胞。

12、作为进一步技术方案，所述外膜囊泡来源于工程化的革兰氏阴性菌尼氏大肠杆菌，富含病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，pamps)，能够有效激活免疫细胞。

13、在一个具体的实施方案中，未成熟的树突状细胞和巨噬细胞分别被给予工程化外膜囊泡处理24h，流式结果表明，对比pbs空白组，工程化外膜囊泡处理的树突状细胞和巨噬细胞大量分化为成熟的树突状细胞和巨噬细胞，说明外膜囊泡对免疫细胞具有显著激活作用；优选的，所述巨噬细胞为骨髓来源巨噬细胞(bmdms)，所述树突状细胞为骨髓来源树突状细胞(bmdcs)。

14、本发明所提供的工程化外膜囊泡，在修饰多聚化纳米抗体后，保持对肿瘤细胞的靶向识别能力。

15、在一个具体的实施方案中，cy5标记的支架外膜囊泡和工程化外膜囊泡与肿瘤细胞共孵育1h后共聚焦结果显示，对比支架外膜囊泡，工程化外膜囊泡处理后的肿瘤细胞表面显示更强的cy5荧光信号，说明多聚化纳米抗体增强了工程化外膜囊泡对肿瘤细胞的亲和力和识别能力；优选的，所述肿瘤细胞为b16-f10黑色素瘤细胞。

16、第二方面，本发明提供了上述具有免疫细胞衔接器功能的工程化外膜囊泡的制备方法，包括以下步骤：

17、1)构建工程化的尼氏大肠杆菌；

18、2)将包含表达ompa-spycatcher003融合蛋白的重组载体转化至宿主中，转化后的宿主细菌进行培养，分离支架外膜囊泡；

19、3)分离的支架外膜囊泡与两种多聚化纳米抗体孵育，得到工程化外膜囊泡。

20、作为进一步技术方案，所述工程化尼氏大肠杆菌为野生型尼氏大肠杆菌敲除ompa和msbb基因所得。

21、作为进一步技术方案，所述重组载体为pbad24。

22、作为进一步技术方案，所述工程化外膜囊泡负载两种多聚化纳米抗体的机制：

23、通过spycatcher003/spytag003和snoopcatcher/snooptag两个系统的生物正交性进行偶联。

24、在一些可选的实施方案中，支架外膜囊泡的提取包括以下步骤：

25、(1)将已经转染重组质粒(pbad24-ompa-spycatcher003)的大肠杆菌加入到lb培养基中活化；(2)将活化后大肠杆菌以1：100的比例接入200ml的lb培养基中于37℃和220rpm的培养至od＝0.6；(3)向培养基中加入阿拉伯糖至终浓度为2g/l，继续培养16h；(4)将细菌悬液8000rpm离心，所得上清液用0.45μm过滤器过滤以去除细菌；(5)纯化的上清用截留量为100kda的超滤管浓缩至10-20ml；(6)按厂家方案使用外膜囊泡提取试剂盒(辽宁润基生物)提取支架外膜囊泡，提取后的外膜囊泡用0.22μm过滤器过滤以彻底去除细菌；(7)测定支架外膜囊泡浓度后储存在-80℃冰箱中。

26、在一个具体的实施方案中，所述的支架外膜囊泡通过western blot方法验证了成功展示了spycatcher003蛋白。

27、在一些可选的实施方案中，还包括了将支架外膜囊泡修饰为工程化外膜囊泡的步骤：

28、(1)将过量的多聚化纳米抗体和支架外膜囊泡在pbs中于4℃过夜孵育；(2)将孵育后混合物用截留量为100kda的超滤管过滤多次以去除多余的多聚化纳米抗体；(3)加入适量pbs定量至目的浓度。

29、在一些可选的实施方案中，所述工程化外膜囊泡通过western blot方法验证了其成功修饰了多聚化纳米抗体。

30、本发明所述工程化外膜囊泡负载两种多聚化纳米抗体的机制为，通过spycatcher003/spytag003和snoopcatcher/snooptag两个系统的生物正交性进行偶联。该策略的优势是能够最大程度保留纳米抗体的活性。

31、在一个具体的实施方案中，三种策略被设计来将两种多聚化纳米抗体共修饰到支架外膜囊泡表面，经对两种多聚化纳米抗体的活性进行评价后发现，通过spycatcher003/spytag003和snoopcatcher/snooptag两个系统的生物正交性进行偶联修饰的策略最优。

32、第三方面，本发明提供了所述的工程化外膜囊泡在制备治疗肿瘤药物中的应用。

33、本发明所提供的具有免疫细胞衔接器功能的工程化外膜囊泡能够在肿瘤内招募巨噬细胞和t细胞两种免疫细胞，引发炎症反应；工程化外膜囊泡表面修饰的两种多聚化纳米抗体能够同时阻断肿瘤细胞表面的cd47和pd-l1蛋白引发的免疫抑制，增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬和t细胞对肿瘤细胞的杀伤，有效抑制肿瘤生长。在一个具体方案中，所述肿瘤为黑色素瘤。

34、与现有技术相比，本发明有以下优势：

35、(1)本发明提供的具有免疫细胞衔接器功能的工程化外膜囊泡，支架为革兰氏阴性菌来源的外膜囊泡，能够高效激活免疫反应，招募免疫细胞向肿瘤组织迁移。

36、(2)本发明提供的具有免疫细胞衔接器功能的工程化外膜囊泡，利用spycatcher系统改造外膜囊泡,实现即插即用的功能，并利用spycatcher003/spytag003和snoopcatcher/snooptag两个系统的生物正交性，实现多个蛋白在外膜囊泡表面的偶联修饰，最大程度保留目标蛋白活性。

37、(3)本发明提供的具有免疫细胞衔接器功能的工程化外膜囊泡，表面修饰的纳米抗体通过多聚化，增强了纳米抗体的活性。

38、(4)本发明提供的具有免疫细胞衔接器功能的工程化外膜囊泡，表面修饰的两种多聚化纳米抗体，可以特异识别肿瘤细胞表面蛋白cd47和pd-l1，同时阻断cd47/sirpα和pd-1/pd-l1免疫检查点，增强巨噬细胞和t细胞对肿瘤细胞的杀伤。