基于KASP技术开发的杜鹃花核心SNP分子标记集、引物集及应用

本发明属于分子生物学及植物分子育种，具体涉及基于kasp技术开发的杜鹃花核心snp分子标记集、引物集及其应用。

背景技术：

1、杜鹃花是世界著名的观赏花卉，也是我国十大传统名花之一。随着我国杜鹃花种质资源整理保护工作的不断推进，以及杜鹃花育成品种数量的逐年增多，出现一系列的问题，包括如何判断相似品种、如何认定假冒品种等。现阶段对杜鹃品种资源亲缘关系的梳理、品种群的分类以及杜鹃新品种的选育与鉴定主要依靠观察形态学特征和农艺性状，其工作周期长，易受栽培措施、环境条件以及人为因素的影响，成为高效利用种质资源和进行品种鉴定的瓶颈之一。

2、近年来，分子生物学的发展使品种鉴定进入到基因水平，与传统的形态学方法和蛋白质电泳技术相比，dna标记技术能揭示更多的多态性，具有准确可靠、简单快速、易于自动化的优点，是品种鉴定技术的发展趋势。国际植物新品种保护联盟(upov)于2010年发布了dna分子标记选择和数据库构建指南(简称bmt指南)，并指出ssr和snp标记是特别适用于品种鉴定的方法。ssr标记具有多态性高、呈共显性等优点，在品种鉴定工作中得到比较成熟且广泛的应用。但在实践过程中，也暴露出其检测位点较少、结果代表性较差、不宜实现数据共享等难以克服的缺陷。虽然ssr标记已在杜鹃品种资源分类中得到应用，具有多态性高、操作简单等优点，但其无法满足大规模、高通量、自动化的检测需求。

3、snp标记作为第三代分子标记，与ssr标记相比具有以下优势：一是在基因组中密度更高、分布更均匀；二是鉴定简单，可用于快速、高通量的基因分型分析；三是更适合数据库整合和数据共享；四是与功能基因甚至植物表型关联度高。因此，snp标记目前被公认是极具应用前景的分子标记技术。snp位点有基于测序、芯片及pcr等各种平台的检测方法。其中，kasp(competitive allele-specific pcr，竞争性等位基因特异性pcr)是一种基于荧光检测的基因分型技术，即基于引物末端碱基的特异匹配对snp进行分型，并通过两个位点特异探针以及2个荧光探针来检测多个snp位点，从而对目标snp进行精准的双等位基因分型。该技术与其他snp基因分型方法相比，具有高度稳定性与准确性、可在基础分子实验室进行、基因型调用的吞吐量高、检测成本低等优点。kasp技术目前主要被应用于snp或indel基因的分型研究中，已在多种农作物和园艺植物的dna指纹、遗传多样性分析和分子标记辅助选择育种中发挥重要作用。

4、和杜鹃花特性相关联的snp位点多达几十万到上百万个，目前尚未见到基于kasp技术的一组snp分子标记集来对杜鹃花种质或品种进行鉴定。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了基于kasp技术开发的杜鹃花核心snp分子标记集，基于上述snp分子标记集可以实现对杜鹃花种质和品种的快速、高通量的鉴定评价。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

3、首先，本技术提供了基于kasp技术开发的杜鹃花核心snp分子标记集，所述杜鹃花核心snp分子标记集包括31个snp标记，所述31个snp标记的编号为snp1～31(snp1、snp2、snp3、snp4、snp5、snp6、snp7、snp8、snp9、snp10、snp11、snp12、snp13、snp14、snp15、snp16、snp17、snp18、snp19、snp20、snp21、snp22、snp23、snp24、snp25、snp26、snp27、snp28、snp29、snp30、snp31)；

4、所述snp1标记为碱基c/a，位于映山红亚属杜鹃花1号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第43229715位；

5、所述snp2标记为碱基g/t，位于映山红亚属杜鹃花1号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第46014657位；

6、所述snp3标记为碱基c/a，位于映山红亚属杜鹃花2号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第12166301位；

7、所述snp4标记为碱基a/t，位于映山红亚属杜鹃花2号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第33907816位；

8、所述snp5标记为碱基g/a，位于映山红亚属杜鹃花2号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第34113381位；

9、所述snp6标记为碱基a/g，位于映山红亚属杜鹃花2号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第39213730位；

10、所述snp7标记为碱基c/a，位于映山红亚属杜鹃花3号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第11204455位；

11、所述snp8标记为碱基c/t，位于映山红亚属杜鹃花3号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第12590717位；

12、所述snp9标记为碱基c/t，位于映山红亚属杜鹃花3号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第14864773位；

13、所述snp10标记为碱基t/a，位于映山红亚属杜鹃花3号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第15859937位；

14、所述snp11标记为碱基c/t，位于映山红亚属杜鹃花3号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第20040775位；

15、所述snp12标记为碱基t/c，位于映山红亚属杜鹃花3号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第20624365位；

16、所述snp13标记为碱基a/g，位于映山红亚属杜鹃花3号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第20637059位；

17、所述snp14标记为碱基a/g，位于映山红亚属杜鹃花3号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第23321340位；

18、所述snp15标记为碱基c/t，位于映山红亚属杜鹃花3号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第23398629位；

19、所述snp16标记为碱基t/c，位于映山红亚属杜鹃花3号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第23933405位；

20、所述snp17标记为碱基g/t，位于映山红亚属杜鹃花3号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第36725782位；

21、所述snp18标记为碱基c/t，位于映山红亚属杜鹃花3号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第61370位；

22、所述snp19标记为碱基c/g，位于映山红亚属杜鹃花4号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第34996743位；

23、所述snp20标记为碱基t/g，位于映山红亚属杜鹃花5号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第22571961位；

24、所述snp21标记为碱基t/c，位于映山红亚属杜鹃花5号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第27906010位；

25、所述snp22标记为碱基g/t，位于映山红亚属杜鹃花8号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第10648788位；

26、所述snp23标记为碱基t/a，位于映山红亚属杜鹃花8号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第16412984位；

27、所述snp24标记为碱基t/c，位于映山红亚属杜鹃花8号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第18007550位；

28、所述snp25标记为碱基g/a，位于映山红亚属杜鹃花8号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第28274862位；

29、所述snp26标记为碱基g/a，位于映山红亚属杜鹃花8号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第5119595位；

30、所述snp27标记为碱基a/g，位于映山红亚属杜鹃花9号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第12789904位；

31、所述snp28标记为碱基g/t，位于映山红亚属杜鹃花9号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第15197698位；

32、所述snp29标记为碱基g/c，位于映山红亚属杜鹃花9号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第18195438位；

33、所述snp30标记为碱基g/a，位于映山红亚属杜鹃花11号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第26381988位；

34、所述snp31标记为碱基t/a，位于映山红亚属杜鹃花12号染色体上，位置为映山红亚属杜鹃花全基因组序列的第12868899位。

35、上述snp物理位置是基于杜鹃花rhododendron simsii的全基因组序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term＝txid118357[orgn])确定的。

36、这31个snp标记为实施例利用200个标记在527个品种中进行筛选鉴定，最终筛获得，可以有效区分杜鹃花品种。

37、其次，本技术还提供了用于扩增上述杜鹃花核心snp分子标记集的kasp引物集，该引物集包含31个kasp引物组，每个kasp引物组用于检测对应的snp标记，每个kasp引物组由两条末端碱基不同的等位基因正向引物f1和正向引物f2以及一条反向引物r构成；这些正向引物f1的5’端添加核苷酸序列如seq id no.94所示的fam荧光标签；正向引物f2的5’端添加核苷酸序列如seq id no.95所示的hex荧光标签。

38、具体地，上述用于检测对应的snp标记的kasp引物集为：检测snp1标记对应的kasp引物组如seq id no.1～3的核苷酸序列所示，检测snp2标记对应的kasp引物组如seq idno.4～6的核苷酸序列所示，检测snp3标记对应的kasp引物组如seq id no.7～9的核苷酸序列所示，检测snp4标记对应的kasp引物组如seq id no.10～12的核苷酸序列所示，检测snp5标记对应的kasp引物组如seq id no.13～15的核苷酸序列所示，检测snp6标记对应的kasp引物组如seq id no.16～18的核苷酸序列所示，检测snp7标记对应的kasp引物组如seq id no.19～21的核苷酸序列所示，检测snp8标记对应的kasp引物组如seq id no.22～24的核苷酸序列所示，检测snp9标记对应的kasp引物组如seq id no.25～27的核苷酸序列所示，检测snp10标记对应的kasp引物组如seq id no.28～30的核苷酸序列所示，检测snp11标记对应的kasp引物组如seq id no.31～33的核苷酸序列所示，检测snp12标记对应的kasp引物组如seq id no.34～36的核苷酸序列所示，检测snp13标记对应的kasp引物组如seq id no.37～39的核苷酸序列所示，检测snp14标记对应的kasp引物组如seq idno.40～42的核苷酸序列所示，检测snp15标记对应的kasp引物组如seq id no.43～45的核苷酸序列所示，检测snp16标记对应的kasp引物组如seq id no.46～48的核苷酸序列所示，检测snp17标记对应的kasp引物组如seq id no.49～51的核苷酸序列所示，检测snp18标记对应的kasp引物组如seq id no.52～54的核苷酸序列所示，检测snp19标记对应的kasp引物组如seq id no.55～57的核苷酸序列所示，检测snp20标记对应的kasp引物组如seq idno.58～60的核苷酸序列所示，检测snp21标记对应的kasp引物组如seq id no.61～63的核苷酸序列所示，检测snp22标记对应的kasp引物组如seq id no.64～66的核苷酸序列所示，检测snp23标记对应的kasp引物组如seq id no.67～69的核苷酸序列所示，检测snp24标记对应的kasp引物组如seq id no.70～72的核苷酸序列所示，检测snp25标记对应的kasp引物组如seq id no.73～75的核苷酸序列所示，检测snp26标记对应的kasp引物组如seq idno.76～78的核苷酸序列所示，检测snp27标记对应的kasp引物组如seq id no.79～81的核苷酸序列所示，检测snp28标记对应的kasp引物组如seq id no.82～84的核苷酸序列所示，检测snp29标记对应的kasp引物组如seq id no.85～87的核苷酸序列所示，检测snp30标记对应的kasp引物组如seq id no.88～90的核苷酸序列所示，检测snp31标记对应的kasp引物组如seq id no.91～93的核苷酸序列所示。

39、第三，本技术还提供了含有上述kasp引物集的试剂盒和芯片。

40、第四，本技术还提供了上述杜鹃花核心snp分子标记集或上述kasp引物集或上述检测产品在以下任一方面中的应用：

41、(1)杜鹃花种质资源或者品种的鉴定；

42、(2)杜鹃花种质资源或者品种的纯度检测；

43、(3)杜鹃花的遗传多样性分析；

44、(4)杜鹃花snp指纹图库的构建；

45、(5)杜鹃花的遗传图谱构建及基因分型；

46、(6)杜鹃花的分子标记辅助育种。

47、优选地，上述应用的具体方法包括一下步骤：

48、s1、提取杜鹃花样品叶片的基因组dna；具体步骤如下：

49、s.1.1取杜鹃花新鲜嫩叶0.2g，剪碎放入2ml离心管中，加入一颗干净的钢珠，液氮冷冻之后，1100rpm振动40s，获得粉末；向每个对应管子中加入600μl改良的2％ctab提取缓冲液(在质量百分数为2％ctab提取液中加入终浓度分别为2％的pvp和1％的巯基乙醇)，充分振荡摇匀混匀后置于65℃水浴中温浴30min，每隔10min摇动一次；然后静置，自然冷却至室温；

50、s.1.2于4℃下12000rpm离心10min，取上清液转移到新的2ml离心管；

51、s.1.3加入与步骤s.1.2中获得的上清液等体积的氯仿/异戊醇混合液(氯仿与异戊醇按照体积比24：1混合后获得)，颠倒混匀，静置3-5分钟，在4℃下12000rpm离心10min，取上清转入新的1.5ml离心管中；

52、s.1.4重复步骤s.1.3一次；

53、s.1.5加与步骤s.1.4中获得的上清液等体积的异丙醇(-20℃下预冷)，缓慢混匀，缓慢颠倒20次，置于-20℃下培养30min；

54、s.1.6在4℃下12000rpm离心10min，取沉淀分别加入800μl 75％(质量百分数)和95％(质量百分数)酒精洗涤两次沉淀，弃上清，取沉淀室温下于通风橱中晾干；然后加入适量的灭菌水溶解，获得杜鹃花样品基因组dna；4℃存储，备用；

55、s2、以步骤s1中的杜鹃花样品基因组dna为模板，分别采用上述与snp标记对应的kasp引物组进行pcr扩增，并将pcr扩增产物放置在bio-radcfx connecttm实时荧光定量pcr仪上获取对应的产物荧光信号值，完成基因分型；

56、s3、采用数据分析软件bio-radcfxmanager3.1对步骤s2的实验结果进行分析，即获得杜鹃花样品的基因分型信息。

57、进一步地，pcr扩增的反应体系为6μl，包括3ng/μl的模板dna2.75μl，与snp标记对应的kasp引物组0.25μl(正向f1引物(10μm)和正向f2引物(10μm)各0.05μl，反向r引物(10μm)0.15μl))，以及2×kaspmastermix3μl。

58、进一步地，pcr扩增的反应条件为：95℃，10min；95℃，20sec，61℃～55℃，1min，每个循环降0.6℃，共10个循环；95℃，20sec，55℃，1min，共35个循环；荧光信号值的读取条件为25℃，30sec。

59、与现有技术相比，本发明的有益效果是：本技术基于kasp技术开发筛选的杜鹃花snp核心分子标记集/引物集，能够快速、准确、有效地鉴定评价杜鹃花的资源或者品种，检测它们的纯度，可以解决因大量种质积累而带来的资源冗余、保存管理不便以及知识产权纠纷等问题，同时可用于杜鹃花snp指纹图库构建、杜鹃花遗传多样性分析及杜鹃花分子标记辅助育种中。