一种TNT及其中间毒副产物降解菌剂的制备及应用方法

本发明属于微生物修复领域，具体涉及一种tnt及其中间毒副产物降解菌剂的制备及应用方法。

背景技术：

1、tnt(2,4,6-三硝基甲苯)是生产制造混合炸药、发射药、固体推进剂的基本材料，是完成枪炮弹丸发射、火箭导弹推进的动力能源，是战斗部进行毁伤的威力能源。tnt的性能在很大程度上决定了武器装备的战技水平，也是发展先进武器装备的关键物质基础。tnt的应用导致三方面的环境问题：(a)通过空气和地表水运输的污染物迁移；(b)tnt与周围生态受体的潜在反应；(c)tnt通过运输进入到周围土壤和地下水。其中第三种污染是炸药污染的主要途径，对农作物等粮食和经济作物的生产造成了不可估量的损失。tnt是一类有毒物质，被美国环境保护署(usepa)定义为高致突变物。其环境转化产物如芳香胺、芳香羟胺以及浓缩产物具有相似或更大的毒性。可以通过呼吸、皮肤吸收、饮食进入人体，对人体产生毒害作用，轻者头晕、呕吐，重症可导致死亡。

2、目前，关于tnt污染的修复技术主要包括热处理(焚烧)、物理化学方法(化学还原、原位化学反应、电化学方法、石灰处理和化学氧化)和生物降解/修复三类方法。焚烧tnt污染土壤是最有效和最常见的修复技术之一，这一方法精确度高，质量控制好，然而，该方法需要挖掘被污染的土壤，将其运送到焚化炉，并进行物理焚化—所有这些操作成本非常昂贵，而且对大规模的场地污染效率很低。石灰处理和化学氧化等化学处理方法会造成二次污染，并且处理成本和工艺需要精确控制。生物修复由于其成本低、不易造成二次污染成为研究热点。生物修复技术中，堆肥修复成本更低，但其处理量较大；植物修复速度慢，且适合较低浓度tnt污染土壤修复；微生物修复速度较植物修复快，且耐受浓度相对较高，成为了处理tnt污染的理想方法之一。

3、tnt在土壤生态系统物理、化学、生物等因素互相作用下产生多种毒副产物进一步威胁土壤健康，包括2-氨基-4,6-二硝基甲苯(2-adnt)、4-氨基-2,6-二硝基甲苯(4-adnt)、2,4-二氨基-6-硝基甲苯(2,4-dant)等。研究发现，tnt、2-adnt以及4-adnt danio rerio致死浓度分别为4.5mg·l-1、13.4mg·l-1以及14.4mg·l-1。污染物对土壤eisenia andrei毒害水平为4-adnt>tnt>2-adnt>2,4-dant。acheta domesticus生殖毒害水平为tnt<2-adnt<4-adnt<2,4-dant。

4、因此，有必要提供耐受/降解tnt及其毒副产物的微生物菌株群修复炸药污染土壤生境，其成果将对弹药污染场地的可持续发展有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是：提供一种tnt及其中间毒副产物降解菌剂的制备及应用方法，为环境修复技术领域弹药污染场地修复提供制备简单、成本低廉，应用方便，适用于tnt及其中间毒副产物降解处理的微生物菌剂。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种tnt及其中间毒副产物降解菌剂，所述降解菌剂包括蔗糖小迫氏菌nn208e(kosakonia sacchari)、深红沙雷氏菌x01(serratia rubidaea)、副地衣芽孢杆菌lxj2(bacillus paralicheniformis)、阿氏芽孢杆菌ls1-1(bacillusaryabhattai)、枯草芽孢杆菌be-91(bacillus subtilis)、铜绿假单胞菌f9676(pseudomonas aeruginosa)。

4、优选地，所述蔗糖小迫氏菌nn208e(kosakonia sacchari)、深红沙雷氏菌x01(serratia rubidaea)、副地衣芽孢杆菌lxj2(bacillus paralicheniformis)、阿氏芽孢杆菌ls 1-1(bacillus aryabhattai)、枯草芽孢杆菌be-91(bacillus subtilis)、铜绿假单胞菌f9676(pseudomonas aeruginosa)，在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号分别为cgmcc no.1.12106、cgmcc no.1.10839、cgmccno.1.15832、cgmcc no.1.15821、cgmcc no.1.15792、cgmcc no.1.15148。

5、第二方面，本发明提供一种第一方面所述tnt及其中间毒副产物降解菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：

6、s1原液混合配料：将蔗糖小迫氏菌nn208e(kosakonia sacchari)、深红沙雷氏菌x01(serratia rubidaea)、副地衣芽孢杆菌lxj2(bacillus paralicheniformis)、阿氏芽孢杆菌ls 1-1(bacillus aryabhattai)、枯草芽孢杆菌be-91(bacillus subtilis)、铜绿假单胞菌f9676(pseudomonas aeruginosa)6种菌液混匀得到混合原液；

7、s2接种：将步骤s1所得混合原液接种于(nh4)2so4 2.0～4.0g/l，nah2po41.5～3.0g/l，质量百分含量为1～3.0％的淀粉，ph 6.0～8.0的发酵培养液中；

8、s3发酵：经28～34℃条件下震荡培养，直至培养液中微生物含量不低于4.0×108cfu/ml，得到tnt及其中间毒副产物降解菌剂，干燥得到tnt及其中间毒副产物降解粉状复合菌剂。

9、优选地，所述步骤s1中，6种菌液为发酵原液，所述发酵原液通过接种菌至含糖源、蛋白源、钙、镁的培养基中得到。

10、进一步地，所述培养基为葡萄糖10.0g/l，蛋白胨10.0g/l，cacl2 1.5g/l，mgso41.5g/l，ph 7.0的基础培养基；接种量为2.0％(v)，180r/min，37℃发酵36h得到发酵原液。

11、优选地，所述步骤s2中，按体积为10.0％进行接种。

12、第三方面，本发明提供一种第一方面所述tnt及其中间毒副产物降解菌剂的应用方法，具体包括如下步骤：在tnt及其中间毒副产物污染土壤中，按10％～15％的重量百分比加入并混合均匀，自然堆存进行降解。

13、优选地，所述自然堆存时长为30～60天。

14、优选地，所述自然堆存的条件为土壤含水率30～50％，环境温度5～35℃，光照时间8～15h/天。

15、本发明的有益效果：

16、本发明选用蔗糖小迫氏菌nn208e(kosakonia sacchari)、深红沙雷氏菌x01(serratia rubidaea)、副地衣芽孢杆菌lxj2(bacillus paralicheniformis)、阿氏芽孢杆菌ls 1-1(bacillus aryabhattai)、枯草芽孢杆菌be-91(bacillus subtilis)、铜绿假单胞菌f9676(pseudomonas aeruginosa)等具有很大实际应用价值的活性菌株，主要依靠两种作用方式降解tnt及其中间毒副产物：其一，通过微生物分泌的胞外酶降解；其二，污染物被微生物吸收至其细胞内后，由胞内酶降解。催化tnt生物降解的第一步为还原反应，分为硝基还原和芳环的直接加氧还原，随着还原反应的进行，tnt的还原产物可在其它酶的催化下被继续转化并以nh4+或no2-的形式释放出氮源。本发明生物酶用量少、成本低，使用后能快速修复tnt及其中间毒副产物污染土壤。