一种犬精子低温保存液及保存方法与流程

本发明属于犬精子低温保存，涉及犬精子低温保存液，具体是涉及一种犬精子低温保存液及保存方法。

背景技术：

1、犬科动物如beagle犬(比格犬)，品种固定且优良，遗传性能稳定、重复性好，对环境的适应力、抗病力较强，性格温顺，被公认为理想的实验动物，广泛应用于医药研究等领域，尤其在新药安全评价与研发领域是世界公认的首选用犬。随着生物医药的快速发展，实验beagle犬年需求逐年上涨，目前已成为科技战略资源。但beagle犬是国外引进的非本土特色实验动物资源，国外已将beagle犬种质资源作为战略资源来保护，不对外供种。因此，保有并利用好国内有限的实验犬种质资源，意义重大。体外保种可实现对种犬遗传信息的长期保存，能预防群体内的遗传变异；向繁育机构提供种子，若使用体外保存的精液，能降低运输成本，避免种犬的运输应激、地域环境差异对犬只的影响以及自然交配中存在的配种困难；在繁殖育种技术上，使用体外保存的精液可提高优质种公犬的利用率，加快品种改良步伐，推进育种工作的进程；在保种成本上，体外保种相对活体保种而言，成本大大降低。因此，为了更好地进行实验用beagle犬种质资源的体外保存，对beagle犬精液体外保存的探究十分重要。

2、犬精液体外保存主要有冷冻保存(-196℃)和低温保存(2～8℃)两种方法，虽然精子低温保存的保存时间远不如冷冻保存，但是它程序简单、便于短距离运输，制作成本相对较低，并且有研究表明使用低温保存的精子人工授精后，受胎率和产仔率高于冷冻保存的精子。因此，对犬精液低温保存的研究也具有重要的推广意义。在体外保存的过程中，随着温度降低，精子细胞内的抗氧化相关的酶活性也会逐渐降低。同时，大量ros从死亡和损伤的精子中释放，导致精子细胞的氧化与抗氧化失衡，使过量的ros在精子细胞中积累。多余的ros会攻击精子质膜、顶体和线粒体，损害精子功能，影响精子与卵子结合，甚至导致精子死亡。所以体外低温保存后精子质量会下降，并且保存时间越长，精子质量损伤越严重，复苏后可成功受精概率越低。

3、因此，急需开发一种能有效减少犬精子低温保存质量损伤，延长低温保存时间的犬精子低温保存液，来提高犬复苏精子的运动能力、结构完整性和抗氧化能力，进而提高犬精子体外低温保存的时间和品质，提高复苏精子成功受精的可能性。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的是提供一种犬精子低温保存液及保存方法，所述犬精子低温保存液能在低温状态下有效保护犬精子，能够使犬精子低温保存0-8天后，复苏犬精子的运动能力保持较高水平，且具有很好的质膜完整性和顶体完整性。

2、实现上述目的技术方案包括如下。

3、本发明的第一个方面，是提供一种犬精子低温保存液，所述低温保存液为包含以下浓度组分的水溶液：0.25mg/ml～0.50mg/ml黄芪多糖、18v/v％～22v/v％卵黄、28mg/ml～32mg/ml三羟甲基氨基甲烷(tris)、15mg/ml～20mg/ml柠檬酸、10mg/ml～15mg/ml果糖。

4、在其中的一些实施例中，在所述低温保存液中，所述黄芪多糖在的浓度为0.40mg/ml～0.50mg/ml。

5、在其中的一些实施例中，在所述低温保存液中，所述黄芪多糖的浓度为0.25mg/ml或0.50mg/ml。

6、在其中的一些实施例中，在所述低温保存液中，所述卵黄的体积浓度为19v/v％～21v/v％，所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为30mg/ml～31mg/ml，所述柠檬酸的浓度为16mg/ml～18mg/ml，所述果糖的浓度为11mg/ml～13mg/ml。

7、在其中的一些实施例中，所述犬为beagle犬。

8、本发明的第二个方面，是提供一种犬精子低温保存方法，包括以下步骤：将犬精子置于如上所述的低温保存液中，于2℃～8℃条件下保存。

9、在其中的一些实施例中，所述犬精子低温保存方法包括以下步骤：将犬精子置于如上所述的低温保存液中，于37℃～39℃孵育20min～40min，然后于15℃～18℃放置0.5h～1.5h，最后于2℃～8℃条件下保存。

10、在其中的一些实施例中，于2℃～4℃条件下保存。

11、在其中的一些实施例中，于4℃条件下保存。

12、在其中的一些实施例中，所述保存的时间为8天以内。

13、在其中的一些实施例中，所述犬精子在所述低温保存液中的密度为100×106个/ml～150×106个/ml。

14、本发明具有以下有益效果：

15、体外低温(2℃～8℃)保存过程中犬精子运动能力、质膜完整性和顶体完整性受损，影响复苏后受精成功率，且低温可保存时间往往较短。本发明针对犬精子体外低温保存时质量受损和保存时间短的问题进行了大量的研究，获得了一种能在体外低温条件下有效保护犬精子的低温保存液，通过在特定配方的稀释液中加入合适量的黄芪多糖(0.25mg/ml～0.50mg/ml)得到的所述犬精子低温保存液，能在低温状态下形成有效保护犬精子的环境，获得了常规抗氧化添加剂所不具有的更好的低温保存效果，使得犬精子在2℃～8℃低温条件下保存8天后，复苏犬精子的运动能力保持较高水平，而且，特别地，相对常规的抗氧化添加剂，本发明所述的犬精子低温保存液能够保持复苏犬精子在0-8天中具有很好的质膜完整性和顶体完整性，从而能够极大地保证后续受精成功率。

技术特征：

1.一种犬精子低温保存液，其特征在于，所述低温保存液为包含以下浓度组分的水溶液：0.25mg/ml～0.50mg/ml黄芪多糖、18v/v％～22v/v％卵黄、28mg/ml～32mg/ml三羟甲基氨基甲烷、15mg/ml～20mg/ml柠檬酸、10mg/ml～15mg/ml果糖。

2.如权利要求1所述的犬精子低温保存液，其特征在于，在所述低温保存液中，所述黄芪多糖的浓度为0.40mg/ml～0.50mg/ml。

3.如权利要求1所述的犬精子低温保存液，其特征在于，在所述低温保存液中，所述黄芪多糖的浓度为0.25mg/ml或0.50mg/ml。

4.如权利要求1～3任一项所述的犬精子低温保存液，其特征在于，在所述低温保存液中，所述卵黄的体积浓度为19v/v％～21v/v％，所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为30mg/ml～31mg/ml，所述柠檬酸的浓度为16mg/ml～18mg/ml，所述果糖的浓度为11mg/ml～13mg/ml。

5.如权利要求1所述的犬精子低温保存液，其特征在于，所述犬为beagle犬。

6.一种犬精子低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤：将犬精子置于如权利要求1～5任一项所述的低温保存液中，于2℃～8℃条件下保存。

7.如权利要求6所述的犬精子低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤：将犬精子置于如权利要求1～5任一项所述的低温保存液中，于37℃～39℃孵育20min～40min，然后于15℃～18℃放置0.5h～1.5h，最后于2℃～8℃条件下保存。

8.如权利要求6或7所述的犬精子低温保存方法，其特征在于，于2℃～4℃条件下保存。

9.如权利要求6所述的犬精子低温保存方法，其特征在于，所述保存的时间为8天以内。

10.如权利要求6～9任一项所述的犬精子低温保存方法，其特征在于，所述犬精子在所述低温保存液中的密度为100×106个/ml～150×106个/ml。

技术总结本发明涉及一种犬精子低温保存液及保存方法，其为包含以下浓度组分的水溶液：0.25mg/ml～0.50mg/ml黄芪多糖、18v/v％～22v/v％卵黄、28mg/ml～32mg/ml三羟甲基氨基甲烷、15mg/ml～20mg/ml柠檬酸、10mg/ml～15mg/ml果糖。所述保存方法包括将犬精子置于所述的低温保存液中，于温度为2℃～8℃条件下保存。通过在稀释液中加入合适量的黄芪多糖(0.25mg/ml～0.50mg/ml)得到的所述犬精子低温保存液，能在低温状态下形成有效保护犬精子的环境，获得了常规抗氧化添加剂所不具有的更好的低温保存效果，使得犬精子在2℃～8℃低温条件下保存8天后，复苏犬精子的运动能力保持较高水平，而且，相对常规的抗氧化添加剂，本发明所述的犬精子低温保存液能够保持复苏犬精子在0‑8天中具有很好的质膜完整性和顶体完整性，从而能够极大地保证后续受精成功率。技术研发人员：胡敏华,黄晓刚,周治东,赵志宏,汪荣根,倪庆纯,刘瑞妍,吴炎方受保护的技术使用者：广州医药研究总院有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/29