一种毛叶枣组织培养再生体系的构建方法与流程

本发明涉及木本果树植物组织培养繁育，具体涉及一种毛叶枣组织培养再生体系的构建方法。

背景技术：

1、毛叶枣(ziziphus mauritiana lamk)，又称台湾大青枣，为鼠李科枣属常绿小乔木，原产于印度、缅甸、越南与中国。20世纪40年代我国台湾育种专家开始引种毛叶枣，中间经过40年的改良，20世纪80年代才选育出经济价值较高的品种，到20世纪90年代毛叶枣已经发展成为台湾主要的秋冬水果之一。而我国大陆地区则是从20世纪90年代中后期开始从台湾省引种栽培，主要在云南、广西、福建等地种植。目前毛叶枣种苗繁育主要以嫁接为主，新品种研发主要通过自然芽变途径进行筛选。因为枣树是种子败育率较高的果树之一，不辅助萌发的话，种子萌芽率低于40％，而栽培毛叶枣的萌芽率不到20％。谢江辉的试验显示毛叶枣‘福枣’的萌芽率只有7.5％；本项目组初步试验统计数据显示：‘脆蜜’、‘台农11号’、‘台农13号’‘柿子枣’等种子自然萌发率几乎为零。然而以芽变进行新品种研发存在育种目标不可控，育种年限不可预测等问题。

技术实现思路

1、本发明的主要目的，在于解决因毛叶枣种子败育而导致无法获得杂交一代植株的难题。

2、一种毛叶枣组织培养再生体系的构建方法，包括：

3、步骤一：毛叶枣植物材料选择：选择座果25d～30d的毛叶枣幼果；

4、步骤二：外植体材料的获得：从步骤一毛叶枣幼果中取出未发育好的种子，保持外种皮完整，去除附着的果肉备用；

5、步骤三：外植体消毒；

6、步骤四：外植体接种：消毒好的种子取出到接种盘中，将外种皮剥离，取出带毛叶枣幼胚的胚乳，将其平放接入诱导培养基中，置于25±2℃弱光培养间中培养；

7、步骤五：诱导成苗：诱导培养至幼胚发育成子叶胚，胚颜色由透明转为绿色，此时将转绿的胚转接到新的诱导培养基中，放置在环境温度26±2℃、光照强度为1800±100lx、光照/黑暗比例(15～17)：(7～9)的培养间中培养，30±2d为一个继代周期；

8、步骤六：生根培养：待毛叶枣的幼胚生长发育成苗且具有2～3对真叶后转入生根培养基中进行生根壮苗培养，30±2d为一个继代周期；

9、步骤七：炼苗并移栽：将生长有3～5对真叶，株高达到10cm的毛叶枣幼苗进行炼苗、移栽；

10、步骤八：移栽后管理。

11、在本发明中，步骤四中的诱导培养基、步骤五中的诱导培养基、步骤六中的生根培养基均是以ims培养基为基础；其中，所述的ims培养基的基本成分是ms的基础上针对毛叶枣的营养需求进行改良的，包含的成分包括：

12、硝酸钾1800.00mg/l～2000.00mg/l；硝酸铵1600.00mg/l～1700.00mg/l；

13、磷酸二氢钾170.00mg/l～200.00mg/l；硫酸镁350.00mg/l～450.00mg/l；

14、氯化钙400.00mg/l～500.00mg/l；碘化钾0.50mg/l～1.00mg/l；

15、硼酸5.00mg/l～10.00mg/l；硫酸锰20.00mg/l～25.00mg/l；

16、硫酸锌7.00mg/l～10.00mg/l；硫酸铜0.010mg/l～0.050mg/l；

17、氯化钴0.010mg/l～0.050mg/l；乙二胺四乙酸二钠30.00mg/l～40.00mg/l；

18、硫酸亚铁25.00mg/l～30.00mg/l；肌醇80.00mg/l～12.00mg/l；

19、甘氨酸1.00mg/l～5.00mg/l盐酸吡哆醇0.10mg/l～1.00mg/l；

20、盐酸硫胺素0.10mg/l～1.00mg/l；烟酸0.10mg/l～1.00mg/l。

21、在本发明中，诱导培养基组成为ims+(0.1g/l～0.4g/l)6-ba+(27.0g/l～33.0g/l)蔗糖+(6.0g/l～10.0g/l)琼脂，调节培养基ph至5.5～6.0；生根培养基组成为1/2ims+(0.3g/l～0.7g/l)iba+(17.0g/l～23.0g/l)蔗糖+(6.0g/l～10.0g/l)琼脂，调节培养基ph至5.5～6.0；所述1/2ims培养基由ims培养基中硝酸钾、硝酸铵含量减半，其他成分含量不变组成。

22、在本发明中，步骤一中，幼果直径20±3mm。

23、在本发明较佳实施例中，步骤三所述外植体消毒方法为：先用无菌水将取出的种子冲洗一次，然后用75％酒精浸泡20s～40s，倒掉酒精后，用0.1％氯化汞进行种子消毒，消毒时间5min～7min，最后倒掉氯化汞溶液后用无菌水振荡冲洗4～5次，去除种子表面残留的氯化汞后备用。

24、在本发明较佳实施例中，步骤四所述的弱光为自然光。

25、在本发明较佳实施例中，步骤五所述的诱导成苗，将转绿的胚转接到新的诱导培养基中时，上胚轴朝上，下胚轴朝下插入培养基中。

26、在本发明较佳实施例中，步骤六生根培养：待毛叶枣的幼胚生长发育成苗且具有2～3对真叶后转入生根培养基，所述的生根培养基为1/2ims+0.5mg/l iba+20.0g/l蔗糖+8.0g/l琼脂，ph 5.8。

27、在本发明较佳实施例中，步骤七中，首先将组培苗移出培养间放置在自然环境中，打开组培瓶瓶口一部分，通风2～3d后完全打开组培瓶瓶口，通风3～7d，使得组培苗逐步适应移栽环境，待幼苗适应移栽环境后取出幼苗，洗去根部的培养基，略微擦干根部后移栽到消毒杀菌好的基质中。

28、在本发明较佳实施例中，步骤八中，移栽完成后第一次基质需浇透水，喷雾0.05％多菌灵杀菌，维持环境空气湿度60～80％，温度27±2℃，避免阳光直射；间隔1～2d浇一次水，间隔6d～8d喷雾一次杀菌剂，0.05％多菌灵与0.05％甲基托布津交替使用；移栽21d后停止喷雾杀菌剂，开始补充低浓度营养液，0.05％花多多1号水溶肥，之后根据苗生长情况逐步增加营养液浓度，完成再生体系构建。

29、上述移栽用的基质成分为草炭土与黄心土按照3：1的体积比配制而成，基质用0.5％高锰酸钾浸透消毒后晾干或者是用高压灭菌锅进行消毒杀菌。

30、本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。

31、本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。

32、本发明中，所述“室温”即常规环境温度，可以为10～30℃。

33、本技术方案与背景技术相比，具有如下优点：

34、(1)首次利用毛叶枣未发育完全的胚作为外植体构建了毛叶枣再生体系，解决了因毛叶枣种子败育而无法获得杂交一代苗的杂交育种难题；(2)采用25d～30d的原因是发现毛叶枣幼果在35d左右开始败育，时间多余30d或是早于25d诱导率均很低。(3)筛选出适宜培育再生苗的毛叶枣胚发育时期；(4)筛选出适宜毛叶幼胚发育的诱导培养基。