一种TFEB融合基因突变的探针库、检测方法及一种试剂盒

本发明涉及基因测序，具体涉及一种tfeb融合基因突变的探针库、检测方法及一种试剂盒。

背景技术：

1、2016年who更新了肾脏肿瘤病理组织学分类，新增了一种肾细胞癌类型：mit家族(小眼畸形转录因子家族microphthalmia-associated transcription factor family)易位性肾细胞癌。mit家族成员包括mitf，tfe3、tfeb和tfec基因。这类肾细胞癌均涉及mit家族成员基因(mitf、tfe3和tfeb基因)同其它基因形成融合，从而高表达mitf/tfe3/tfeb融合蛋白，而mitf/tfe3/tfeb作为一个转录因子，通过与特异的dna结构相结合，转录调控体内多种基因表达，最终会导致癌症的发生。

2、malat1为tfeb基因最常见的融合伴侣，典型的断裂位点位于tfeb基因3号外显子起始密码子上游的289bp范围内，但随着研究的深入，越来越多位于其他区域的断裂位点被检出。此外也有越来越多的融合伴侣基因被检测到：khdrbs2-tfeb，col21a1-tfeb，actb-tfeb，ewsr1-tfeb，cltc-tfeb及cadm2-tfeb等。不同tfeb融合亚型的患者临床特征和预后可能存在差异，同时有研究表明tfeb基因易位性肾癌与肾脏常见肿瘤在发病机制和治疗方案上均有所区别。精确的检测并区分tefb不同的融合亚型，不仅可以作为患者预后预测的依据，同时能够不断完善这类肿瘤的分子致病机制，为相应靶向药物开发和实验提供基础，具有重要的临床意义。

3、常见的tfeb融合伴侣基因为malat1，另外还有khdrbs2，col21a1，actb，ewsr1，cltc，aspscr1及cadm2等罕见融合伴侣，目前临床常用的传统检测技术fish及ihc很可能出现漏检，此外，传统fish和ihc检测融合，无法判别融合伴侣基因及融合形式。

4、有鉴于此，特提出本申请。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是现有的基因检测技术灵敏度低和准确性低的问题，目的在于提供一种tfeb融合基因突变的探针库、检测方法及一种试剂盒，以解决上述问题。

2、本发明通过下述技术方案实现：

3、本申请提供了一种tfeb融合基因突变的探针库，该探针库包括含有核苷酸序seqidno.1～141中的任意一条探针或具有相同功能的探针；

4、所述具有相同功能的探针由将含有核苷酸序seq id no.1～141中任意一条探针经过若干核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后得到，且与原探针具有相同杂交捕获功能。

5、进一步的，所述的具有相同功能的探针与原探针具有80％以上相同的碱基，优选为与原探针具有90％以上相同碱基，再优选为与原探针具有95％以上相同碱基。

6、为了更好地实现上述目的，本发明还提供一种tfeb融合基因突变的检测方法，包括以下步骤：

7、s1：获得受试者的dna样本库；

8、s2：获得上述所述的tfeb融合基因突变的探针库；

9、s3：将所述探针库与所述dna样本库进行杂交得到杂交产物；

10、s4：将所述杂交产物进行分离，得到tfeb融合基因dna片段；

11、s5：对tfeb融合基因dna片段进行检测。

12、进一步地，s1中所述dna样本库由双链dna片段组成。

13、进一步地，所述双链dna片段的制备方法包括从哺乳动物中提取基因组dna或mrna，然后合成cdna后获得片段化的双链dna片段作为dna样本库。

14、进一步地，s4中所述dna片段的长度为150～600bp。

15、进一步地，s4中所述dna片段的长度为150～200bp。

16、进一步地，在s2中还包括将所述探针库中的各个探针进行生物素化，在s4中包括采用链霉亲和素磁珠吸附所述杂交产物，再从所述链霉亲和素磁珠上释放出富集的tfeb融合基因dna片段。

17、进一步地，s5中所述检测的方法为高通量测序的方法。

18、本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括上述所述的探针库。

19、本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

20、(1)本发明实施例基于杂交选择而捕获特定tfeb融合基因序列的方法，采用该方法可以获得成几千倍富集的tfeb融合基因dna片段，该经富集的tfeb融合基因片段样本可以选择性地应用于各种基因检测技术，特别是可以应用下一代测序技术进行基因突变、缺失、增加、和颠换等方面的检测，以取得高效且准确的结果，对相关症状的后续治疗提供有意义的理论及临床指导。

21、(2)对于将通过本发明的方法富集得到的tfeb融合基因片段用于基于下一代测序技术的基因结构突变检测的应用而言，还具有以下有益效果：使用本发明的基因富集方法及筛选得到的特定dna探针库，能够成数千倍地富集tfeb融合基因片段，从而可以应用下一代测序技术、利用该tfeb融合基因片段的测序，而准确地获得tfeb融合基因的各种突变。并且，由于采用下一代测序技术，因此能够一次性检测多个基因的多种类型基因突变；准确性高，传统技术例如基因芯片技术，通常需要重复两次以上才能确定检测结果，而本发明在一次反应中，对单个碱基进行反复测序，保证了数据的精准度，并且缩短了检测周期；敏感性高，本发明提供的方法和试剂盒能够有效地使对于低突变丰度样本的检测灵敏性得到提高，和传统检测技术相比，本发明产生的数据能够达到碱基级的分辨率。

技术特征：

1.一种tfeb融合基因突变的探针库，其特征在于，该探针库包括含有核苷酸序seq idno.1～141中的任意一条探针或具有相同功能的探针；

2.据权利要求1所述的一种tfeb融合基因突变的探针库，其特征在于，所述的具有相同功能的探针与原探针具有80％以上相同的碱基。

3.一种tfeb融合基因突变的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的一种tfeb融合基因突变的检测方法，其特征在于，s1中所述dna样本库由双链dna片段组成。

5.根据权利要求4所述的一种tfeb融合基因突变的检测方法，其特征在于，所述双链dna片段的制备方法包括从哺乳动物中提取基因组dna或mrna，然后合成cdna后获得片段化的双链dna片段作为dna样本库。

6.根据权利要求5所述的一种tfeb融合基因突变的检测方法，其特征在于，s4中所述dna片段的长度为150～600bp。

7.根据权利要求6所述的一种tfeb融合基因突变的检测方法，其特征在于，s4中所述dna片段的长度为150～200bp。

8.根据权利要求3所述的一种tfeb融合基因突变的检测方法，其特征在于，在s2中还包括将所述探针库中的各个探针进行生物素化，在s4中包括采用链霉亲和素磁珠吸附所述杂交产物，再从所述链霉亲和素磁珠上释放出富集的tfeb融合基因dna片段。

9.根据权利要求3所述的一种tfeb融合基因突变的检测方法，其特征在于，s5中所述检测的方法为高通量测序的方法。

10.一种试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1或2所述的探针库。

技术总结本发明公开了一种TFEB融合基因突变的探针库、检测方法及一种试剂盒，涉及基因测序技术领域，包括以下步骤：S1：获得受试者的DNA样本库；S2：获得上述所述的TFEB融合基因突变的探针库；S3：将所述探针库与所述DNA样本库进行杂交得到杂交产物；S4：将所述杂交产物进行分离，得到TFEB融合基因DNA片段；S5：对TFEB融合基因DNA片段进行检测。本发明基于杂交选择而捕获特定TFEB融合基因序列的方法，采用该方法可以获得成几千倍富集的TFEB融合基因DNA片段，该经富集的TFEB融合基因片段样本可以选择性地应用于各种基因检测技术，特别是可以应用下一代测序技术进行基因突变、缺失、增加、和颠换等方面的检测，以取得高效且准确的结果。技术研发人员：龚波,周玉,李欢,于天枢,邵阳,吴晓英,逄娇慧,汪笑男,陶学锐,吴逸霄,盛蓝月受保护的技术使用者：四川省医学科学院·四川省人民医院技术研发日：技术公布日：2024/9/29