一种基于全基因合成高效制备纳米银的蛋白YNA15及其编码基因和应用

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于全基因合成高效制备纳米银的蛋白yna15及其编码基因和应用。

背景技术：

1、纳米材料因其具有耐高温、延展性好、比表面积、抗应变能力好、电阻率低等独特性而受到广泛关注，当纳米材料尺寸达到一定范围时，它们的物理性质和化学性质将会改变，纳米银具有优异的导电性能和催化性能，且成本低，它凭借着纳米尺寸效应，其体积小，比表面积大，在表面活性，催化性能和抑菌性能都有较大的提升，在很多领域都有广泛的应用前景：如作为催化剂，抗菌材料，医药材料，电子浆料等纳米银是指银元素的纳米级颗粒，也就是其粒子尺寸在纳米尺度范围内，通常在1到100纳米之间。银纳米颗粒由于其独特的电学、光学和生物学特性，近年来被电子元器件、纳米器件制造、催化、生物传感、药物递送等领域青睐。纳米银制备的导电墨水通过喷墨打印形成纳米银线，以高透明度、导电性、机械柔韧性广泛应用于柔性电子材料领域中；同时纳米颗粒独特的等离子体共振体性质使其可以进行生物标记和传感成像用于医学诊断。纳米银颗粒可以抑制癌细胞增殖，是一种潜在的抗肿瘤制剂。银纳米粒子的抗微生物特性同样备受关注，可以通过浆内添加或者表面涂布的方式制备成导电纸、抗菌纸、电磁屏蔽纸、生物检测纸等功能纸。

2、纳米银的抗菌作用是通过结合和穿透细菌细胞壁而发生的。一旦进入细胞，纳米银就会带来结构变化，扰乱dna、细胞酶和呼吸系统的生化过程，导致细菌死亡。然而，纳米银释放的银离子和纳米银产生的活性氧(ros)，它们负责细菌的生长抑制。由于纳米银的物理和化学性质取决于其尺寸、形状和表面电荷；因此，它们可以直接影响它们的抗菌活性。纳米银对大肠杆菌的形状依赖性抗菌相互作用，其中发现具有晶格平面的截头球形银纳米板具有最强的杀生物作用，并与球形银纳米粒子进行了比较。球形纳米银的尖锐边缘、顶点和高原子密度面被认为具有更高的抗菌作用。

3、纳米银可以通过物理、化学、生物等多种方法合成。物理法原理简单，制备的纳米银颗粒纯度和活度都较高，但颗粒不稳定，能耗大，且对设备要求很高。化学还原法对设备的要求较为简单，且合成的纳米银粒径较窄，分布均匀。但化学还原法通常会使用一些有机溶剂，这些有机溶剂毒性强，污染严重。因此，生物还原法制备纳米银应运而生。该法具有操作简单、成本低和不污染环境等优点，生物合成法通常需要较少的化学品使用，具有反应温和，生产成本低，绿色环保无污染，而且在反应过程当中不需要还原剂等添加剂就可以完成纳米银制备的等一系列优点，随着绿色观念、环保观念的普及，利用生物系统合成纳米银粒子的生物法备受关注，在生物法合成纳米银中，围绕微生物和植物提取物合成纳米银研究很多，关于生物大分子蛋白合成纳米银研究较少，如何获得更多可以合成纳米银的蛋白非常重要。

技术实现思路

1、发明目的：纳米银形貌决定了纳米银性能，现有物理法、化学法、生物法合成纳米银大多是通过改变合成条件和工艺参数实现形貌控制，针对纳米银合成蛋白研究较少和利用大分子蛋白实现纳米银形貌可控合成问题，本发明将非纳米银合成蛋白改造成纳米银合成蛋白，本发明提供一种基于全基因合成高效制备纳米银的蛋白yna15及其编码基因和应用，本发明基于大规模突变获得的蛋白yna15可以更加高效合成纳米银以及提高纳米银的抑菌性能。本发明通过全基因合成dna序列，构建了编码纳米银合成蛋白yna15的基因，本发明构建的全新的纳米银合成蛋白和基因，可以作为新的模版，进一步得可以根据设计要求，精确地调控蛋白的结构和功能，提高了纳米银合成效率。

2、本发明还提供所述载体、工程菌及其应用。

3、技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种基于全基因合成高效制备纳米银的蛋白yna15的编码基因，所述蛋白yna15编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、本发明所述基于全基因合成高效制备纳米银的蛋白yna15，所述蛋白yna15的氨基酸序列如seq id no.2所示。

5、其中，所述蛋白yna15以蛋白8p4y为模版，通过大规模突变氨基酸获得如seq idno.2所示蛋白yna15的编码基因进行全基因合成。

6、进一步地，为了高效合成纳米银，以已知蛋白的氨基酸序列(seq id no.3)为模版，通过对氨基酸编码的蛋白结构进行三维结构模拟和表面电荷预测，分析各结构域的功能和作用，通过模拟电荷分析，大量筛选蛋白8p4y的突变位点，然后进一步的筛选位于表面的氨基酸，对该蛋白的氨基酸序列进行大规模突变，得到的蛋白yna15氨基酸序列，进行全基因合成，获得序列如seq id no.1所示编码高效合成纳米银蛋白的基因，构建重组载体，将重组载体导入原核表达宿主内进行表达纯化。

7、本发明所述重组载体，所述重组载体包括所述的编码基因。

8、其中，所述重组载体以pet-28a为质粒载体携带权利要求1所述的编码基因。

9、本发明所述工程菌，其特征在于，所述工程菌包括所述的基于全基因合成纳米银蛋白yna15的编码基因或者所述的基于全基因合成高效制备纳米银的蛋白yna15或者所述的重组载体。

10、本发明所述的基于全基因合成纳米银蛋白yna15的编码基因或者所述的基于全基因合成高效制备纳米银的蛋白yna15或者所述的重组载体或者所述的工程菌在制备纳米银中的应用。

11、其中，通过生物法在制备纳米银中的应用。

12、其中，所述应用中以硝酸银为底物浓度10～30mm，温度为30～70℃，转速120～220rpm,ph为9～13，反应时间16～24h。

13、其中，所述应用中制备的纳米银为球形纳米银，粒径大小分布于2～25nm。经过扫描电镜sem的表征发现粒径小于10nm的纳米银呈现团聚状态，大多是单颗粒的粒径不超过20nm。4-5个小粒径agnps粒子团聚成50nm左右的纳米团簇，而单颗粒超过20nm的粒子表现出很好的稳定性。分散性较好。其原因在于，纳米颗粒的粒径下降，其表面原子比例增加，导致表面配位数不足和高表面能，从而纳米银处于高度活化状态，从而粒径小的纳米银会呈现出团聚状态。

14、本发明通过大规模突变氨基酸，首先分析8p4y合成纳米银的关键序列，对其序列进行大规模突变，进行全基因合成，能够合成具有生物活性的纳米银。本发明所述基因编码的能够高效合成具有生物活性纳米银的蛋白的核苷酸序列如seq id no.1所示。本发明将目的基因与载体进行连接得到重组载体，将重组载体导入原核表达宿主内进行表达纯化，本发明所述yna15蛋白突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示。

15、本发明运用蛋白质工程的技术人工改造后的蛋白在一定的条件下可以将底物硝酸银还原成纳米银，以更好地揭示纳米银合成机理，同时以酿酒酵母、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，蜡黄芽胞杆菌探究该生物法合成纳米银的抑菌能力。本发明每次纳米银合成条件稳定，合成的纳米银粒径可控，该生物法合成的纳米银具有良好的生物活性。

16、本发明通过在pdb蛋白数据库筛选到蛋白8p4y，其是一个合成结构的蛋白质，可以在大肠杆菌中表达，但是其不具备合成纳米银的能力，本发明以其氨基酸作为模板进行突变获得了基于全基因合成高效合成纳米银的蛋白yna15。

17、本发明利用生物合成学原理，通过合成dna序列，构建了编码纳米银合成蛋白yna15的基因，这使得可以根据设计要求，精确地调控蛋白的结构和功能。本发明的yna15编码的蛋白质具有特定的生物还原性质，能够将银离子还原为纳米银颗粒，这种蛋白质在合成纳米银过程中起到了催化作用，促进了纳米银的形成。

18、本发明通过大规模突变合成的蛋白yna15，可以通过生物合成的方法，更高效地合成纳米银，相比传统的合成方法可能更节省时间和成本，通过调控基因序列，可以精确地控制蛋白质的结构和功能，从而控制纳米银的性质，使其适用于不同的应用场景，生物合成的方法通常更加环保和生物友好，与化学合成相比，减少了对环境的污染和对人体健康的危害。可以根据需要设计不同的蛋白质，以满足特定应用的需求，从而提高了纳米银的定制化程度。

19、本发明利用了全基因合成技术，通过合成dna序列，实现了对编码纳米银合成蛋白yna15的基因的精确设计和控制。相比传统的基因克隆和突变方法，全基因合成技术具有更高的自由度和灵活性，可以更精确地调控蛋白的结构和功能。yna15编码的蛋白质经过了精心设计和优化，具有更高的催化活性和稳定性，能够更有效地将银离子还原为纳米银颗粒。

20、本发明优化设计使得纳米银的合成过程更加高效和可控。实现了纳米银的高效合成和可控性，相比传统方法更节省时间和成本，并且能够精确地调控纳米银的性质。生物合成的方法通常更加环保和生物友好，减少了对环境的污染和对人体健康的危害，与传统的化学合成方法相比具有更高的安全性和可持续性。

21、本发明构建的全新的纳米银合成基因和蛋白，可以作为新的模版，提供更多的突变位点，为后续开发更加优异的纳米银合成蛋白提供材料。

22、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

23、1、本发明经过蛋白质工程，人工改造得到全新的蛋白序列，通过全基因合成能够稳定合成纳米银的蛋白，条件可控，粒径可控，合成成本低，对环境绿色无污染。

24、2、本发明的基于全基因合成得到的yna15蛋白，在温度范围30℃～70℃，ph范围在9～13，合成时间16～24h的条件下，对纳米银的合成效率较高，得到的生物纳米银溶液呈深褐色，性质稳定，粒径大多数分布在2～25nm，具有良好的生物活性和生物学功能。

25、3、本发明通过改造后的yna15蛋白合成的纳米银，粒径可控，合成条件温和，对酿酒酵母、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，蜡黄芽胞杆菌均有良好的抑菌效果，具有及其广阔的应用前景和工业价值。

26、4、本发明经过人工改造的蛋白成功合成了纳米银，发现该改造蛋白的关键功能区域，对其关键区域进行大规模突变，经过重组载体和原核表达，得到可以大量制备具有高效合成生物纳米银能力的工程菌，该蛋白表达量高且蛋白质稳定。本发明有利于揭示利用单一非酶催化蛋白制备纳米银的合成机制。