一种鸡星状病毒和禽肾炎病毒的二重荧光RT-LAMP检测试剂盒的制作方法

本发明涉及生物检测，特别是涉及一种鸡星状病毒和禽肾炎病毒的二重荧光rt-lamp检测试剂盒。

背景技术：

1、鸡星状病毒(chicken astrovirus，castv)和禽肾炎病毒(avian nephritisvirus，anv)是两种常见的鸡源星状病毒(astrovirus，astv)。到目前为止，还没有治疗castv和anv的有效药物和疫苗，只能依靠定期消毒和鸡群净化等措施减轻影响，因此迫切需要一种有效的临床检测技术，为病毒监控提供技术支持。目前尚无关于两种病毒大范围爆发的报道，但在临床上castv和anv常发生混合感染，蛋鸡感染会造成产蛋量下降，且两种病毒都可以通过鸡胚垂直传播，肉鸡感染后可造成发育障碍等症状，对家禽养殖业造成经济损失。因此为了能对两种病毒进行早期诊断和疫病监测，需要一种切实可行的方法应用于临床检测。

2、目前针对castv和anv的检测技术主要为病毒分离、rt-pcr、荧光定量pcr、套式rt-pcr、间接elisa等。以上检测方法都有不同程度的缺点：病毒分离准确可靠，但是耗时长，缺少理想的细胞系；pcr操作简便但耗时长，产物易残留造成假阳性；荧光定量pcr灵敏度高，但仪器要求精密，基层应用受限；elisa方法容易操作，但是检测过程中容易出现假阳性并且每次只能检测一种病毒。随着技术进步，新型检测技术如环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，lamp)被引入禽病检测中，实现高效便捷的诊断。该方法具有操作简单，反应时间短，恒温水浴即可反应，无需昂贵设备等优点。

3、本发明拟开发一种鸡星状病毒和禽肾炎病毒的二重荧光rt-lamp检测试剂盒，从而为鸡星状病毒和禽肾炎病毒的流行病学调查提供技术支持。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种鸡星状病毒和禽肾炎病毒的二重荧光rt-lamp检测试剂盒，以解决上述现有技术存在的问题。该试剂盒具有快速、准确、特异性好、灵敏性高、重复性好等特点，适用于临床诊断，可以为castv和anv的流行病学调查提供技术支持。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种用于鸡星状病毒和禽肾炎病毒的二重荧光rt-lamp检测的引物和探针组合，包括核苷酸序列分别如seq id no.1-14所示的引物castv-f3、引物castv-b3、探针castv-fip、引物castv-bip、引物castv-floop、引物castv-bloop、探针castv-fd、引物anv-f3、引物anv-b3、探针anv-fip、引物anv-bip、引物anv-floop、引物anv-bloop和探针anv-fd。

4、进一步地，所述探针castv-fd和所述探针anv-fd的3ˊ端标记不同的荧光基团；

5、所述探针castv-fip和所述探针anv-fip的5ˊ端标记不同的淬灭基团。

6、进一步地，所述探针castv-fd的3ˊ端标记fam基团；

7、所述探针anv-fd的3ˊ端标记cy3基团；

8、所述探针castv-fip的5ˊ端标记bhq1基团；

9、所述探针anv-fip的5ˊ端标记bhq2基团。

10、本发明还提供一种用于鸡星状病毒荧光rt-lamp检测的引物和探针组合，包括核苷酸序列分别如seq id no.1-7所示的引物castv-f3、引物castv-b3、探针castv-fip、引物castv-bip、引物castv-floop、引物castv-bloop和探针castv-fd。

11、进一步地，所述探针castv-fd的3ˊ端标记荧光基团；

12、所述探针castv-fip的5ˊ端标记淬灭基团。

13、本发明还提供一种用于禽肾炎病毒荧光rt-lamp检测的引物和探针组合，包括核苷酸序列分别如seq id no.8-14所示的引物anv-f3、引物anv-b3、探针anv-fip、引物anv-bip、引物anv-floop、引物anv-bloop和探针anv-fd。

14、进一步地，所述探针anv-fd的3ˊ端标记荧光基团；

15、所述探针anv-fip的5ˊ端标记淬灭基团。

16、本发明还提供上述的用于鸡星状病毒和禽肾炎病毒的二重荧光rt-lamp检测的引物和探针组合在制备鸡星状病毒和禽肾炎病毒的二重荧光rt-lamp检测试剂盒中的应用。

17、本发明还提供一种鸡星状病毒和禽肾炎病毒的二重荧光rt-lamp检测试剂盒，包括用于鸡星状病毒和禽肾炎病毒的二重荧光rt-lamp检测的引物和探针组合。

18、进一步地，所述二重荧光rt-lamp检测试剂盒的反应体系为：2×master mix 12.5μl，bst dna聚合酶0.1μl，引物castv-f3、castv-b3、anv-f3和anv-b3各0.5μl，引物castv-f3、castv-b3、anv-f3和anv-b3各0.5μl，引物castv-floop、castv-bloop、anv-floop和anv-bloop各0.5μl，引物castv-bip和anv-bip各0.5μl，fip-fd 0.5μl，dna/cdna模板2μl，rnase-free water 2.4μl；

19、所述fip-fd包括0.48μmol/l castv-fip-fd和0.32μmol/lanv-fip-fd；

20、所述castv-fip-fd是所述探针castv-fip和所述探针castv-fd退火形成的复合探针；

21、所述anv-fip-fd是所述探针anv-fip和所述探针anv-fd退火形成的复合探针。

22、本发明公开了以下技术效果：

23、本发明根据castv orf1b基因和anv orf1b基因保守序列，分别设计了两套特异性引物和标记荧光基团的探针，在castv探针3ˊ端标记fam荧光基团，5ˊ端标记淬灭基团bhq1；anv探针3ˊ端标记cy3荧光基团，5ˊ端标记淬灭基团bhq2，通过试验筛选出最适引物和探针并进行反应条件的优化。用建立的二重荧光rt-lamp进行特异性，敏感性，重复性和干扰性试验，并对采集自广西壮族自治区南宁市不同地区的临床样品共300份进行检测，结果与r t-qpcr和rt-pcr比较，验证该方法的有效性。试验结果显示：本发明建立的二重荧光rt-lamp方法60min即可反应结束，最适反应温度为65℃；设计的引物仅能检测castv和anv，而对其他病源无交叉反应；castv最低检测限度为1.4×102copies/μl，anv最低检测限度为1.5×102copies/μl，且干扰性试验和重复性试验良好；检测结果与rt-qpcr相比，castv和anv检测结果符合率分别为97.97％和98.85％。综上所述，本发明建立的二重荧光rt-lamp方法具有快速、准确、特异性好、灵敏性高、重复性好等特点，适用于临床诊断，可以为castv和anv的流行病学调查提供技术支持。