用于抑制PNPLA3表达的RNAI构建体及其使用方法与流程

本披露涉及用于调节含patatin样磷脂酶结构域3(pnpla3)的肝表达的组合物和方法。特别地，本披露涉及通过rna干扰降低pnpla3表达的基于核酸的治疗剂、及利用这类基于核酸的治疗剂来治疗或预防肝病，例如非酒精性脂肪性肝病(nafld)的方法。通过引用并入电子提交材料通过引用以其全文并入本文的是与其一并提交的核苷酸/氨基酸序列表并鉴定如下：一个1,930千字节的xml文档，命名为“a-2910-w001-sec.xml”，创建于2023年3月20日。相关申请的交叉引用本技术要求于2022年3月23日提交的美国临时申请号63/322,845的权益。

背景技术：

1、非酒精性脂肪性肝病(nafld)构成一系列肝病变，为世界上最常见的慢性肝病，其患病率在过去20年中翻倍，且如今据估计影响了约20％世界人口(sattar等人(2014)bmj[英国医学杂志]349:g4596；loomba和sanyal(2013)nature reviews gastroenterology&hepatology[自然评论，胃肠病学和肝病学]10(11):686-690；kim和kim(2017)clingastroenterol hepatol[临床胃肠病学和肝病学]15(4):474-485；petta等人(2016)digliver dis[消化病和肝病]48(3):333-342)。nafld开始于肝中的甘油三酯积累，且定义为个体中超过5％肝细胞中存在细胞质脂滴，该个体1)无明显饮酒史且2)其中其他类型肝病的诊断已被排除在外(zhu等人(2016)world j gastroenterol[世界胃肠病学杂志]22(36):8226-33；rinella(2015)jama[美国医学会杂志]313(22):2263-73；yki-jarvinen(2016)diabetologia[糖尿病学]59(6):1104-11)。在一些个体中，肝中异位脂肪的积累(称为脂肪变性)引发炎症和肝细胞损伤，导致更晚期疾病，称为非酒精性脂肪性肝炎(nash)(rinella,同上)。截至2015年，预计有7500万-1亿美国人患有nafld，其中nash约占nafld诊断的10％-30％(rinella,同上；younossi等人(2016)hepatology[肝病学]64(5):1577-1586)。

2、含patatin样磷脂酶结构域3(pnpla3)，以前称为脂联素(adpn)和钙非依赖性磷脂酶a2-ε(ipla(2)ε)，为一种ii型跨膜蛋白(wilson等人(2006)j lipid res[脂类研究杂志]47(9):1940-9；jenkins等人(2004)j biol chem[生物化学杂志]279(47):48968-75)。最初在脂肪细胞中鉴定为在小鼠脂肪形成期间诱导的膜相关性脂肪富集蛋白，其现在已充分表征为在其他组织(包括肝)中表达(wilson等人,同上；baulande等人(2001)j biol chem[生物化学杂志]276(36):33336-44；moldes等人(2006)eur j endocrinol[欧洲内分泌学杂志]155(3):461-8；faraj等人(2006)j endocrinol[内分泌杂志]191(2):427-35；liu等人(2004)j clin endocrinol metab[临床内分泌与代谢杂志]89(6):2684-9；lake等人(2005)j lipid res[脂类研究杂志]46(11):2477-87)。在无细胞生化系统中，重组pnpla3蛋白可以表现出三酰甘油脂肪酶或转酰基化活性(jenkins等人,同上；kumari等人(2012)cell metab[细胞代谢]15(5):691-702；he等人(2010)j biol chem[生物化学杂志]285(9):6706-15)。在肝细胞中，pnpla3在内质网和脂质膜上表达，且主要表现出三酰甘油水解酶活性(he等人,同上；huang等人(2010)proc natl acad sci usa[美国国家科学院院刊]107(17):7892-7；ruhanen等人(2014)j lipid res[脂类研究杂志]55(4):739-46；pingitore等人(2014)biochim biophys acta[生物化学与生物物理学报]1841(4):574-80)。尽管pnpla3缺乏分泌信号，但数据表明它得以分泌且可在人血浆中作为二硫键依赖性多聚体出现(winberg等人(2014)biochem biophys res commun[生物化学和生物物理学研究通讯]446(4):1114-9)。

3、目前，nafld症状是通过减肥和治疗任何继发性病症来控制的，因为尚未批准任何药物治疗。因此，需要治疗受影响个体的nafld的组合物和方法。

技术实现思路

1、本披露提供了包含有义链和反义链的rnai构建体，其中该反义链包含具有与pnpla3 mrna序列(例如如表1所示的pnpla3mrna序列)互补的序列的区域，并且其中该rnai构建体抑制pnpla3的表达。在某些实施例中，rnai构建体包含区域，该区域具有与选自seqid no:565-1068和seq id no:2329-3588的反义序列差异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。在一些实施例中，反义链与表1中列出的pnpla3 mrna序列杂交。

2、在一些实施例中，本文所述的rnai构建体的有义链包含与反义链的序列充分互补以形成长度为约15至约30个碱基对的双链体区的序列。在这些和其他实施例中，有义链和反义链的长度各自为约15至约30个核苷酸。在一些实施例中，rnai构建体包含至少一个钝端。在其他实施例中，rnai构建体包含至少一个核苷酸突出端。此类核苷酸突出端可包含至少1至6个未配对核苷酸，且可位于有义链3'端、反义链3'端、或有义链和反义链两者的3'端。在某些实施例中，rnai构建体在有义链3'端和反义链3'端处包含两个未配对核苷酸的突出端。在其他实施例中，rnai构建体包含在反义链3'端处的两个未配对核苷酸突出端和有义链3'端/反义链5'端的钝端。

3、本披露的rnai构建体可包含一种或多种经修饰的核苷酸，包括对核糖环、核碱基或磷酸二酯主链具有经修饰的核苷酸。在一些实施例中，rnai构建体包含一种或多种经2'-修饰的核苷酸。此类经2'-修饰的核苷酸可包括经2'-氟修饰的核苷酸、经2'-o-甲基修饰的核苷酸、经2'-o-甲氧基乙基修饰的核苷酸、经2'-o-烯丙基修饰的核苷酸、双环核酸(bna)、乙二醇核酸(gna)、反向碱基(例如反向腺苷)或其组合。在一个特定实施例中，rnai构建体包含一个或多个经2'-氟修饰的核苷酸、经2'-o-甲基修饰的核苷酸、或其组合。在一些实施例中，rnai构建体的有义链和反义链中的所有核苷酸均为经修饰的核苷酸。

4、在一些实施例中，rnai构建体包含至少一个主链修饰，例如经修饰的核苷酸间或核苷间键。在某些实施例中，本文所述的rnai构建体包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。在特定实施例中，硫代磷酸酯核苷酸间键可位于有义链和/或反义链的3'或5'端。

5、在一些实施例中，本披露的rnai构建体的反义链和/或有义链可包含来自图1或2中列出的反义和有义序列的序列或由其组成。在某些实施例中，rnai构建体可以包含含有反义链和有义链的双链体化合物，其中该反义链包含选自seq id no:565-1068和seq idno:2329-3588的序列，并且该有义链包含选自seq id no:61-564和seq id no:1069-2328的序列。

6、本披露还提供了包含上述rnai构建体和药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂的组合物，以及在有需要的患者中降低pnpla3表达的方法，这些方法包括向该患者施用上述rnai构建体或组合物。