一种多亚型禽流感病毒混合感染中单一病毒纯化的方法与流程

本发明涉及禽流感病毒纯化，具体涉及一种多亚型禽流感病毒混合感染中单一病毒纯化的方法。

背景技术：

1、近年来，人们对禽流感病毒(avian influenzaviruses，aivs)的遗传变异机制、进化流行趋势和疫苗开发利用等工作给予了空前的重视。而获取大量纯化的aivs流行株是开展这些工作的前提和基础，也是保证工作质量的重要手段。近年来对广西壮族自治区地区活禽中aivs的亚型分布情况进行研究发现多种亚型aivs共同感染同一只家禽的现象非常普遍。如何简单、有效的对混合感染的aivs进行分离和纯化是许多禽流感研究人员必须面对的难题。

2、空斑(蚀斑)纯化法是一条有效的途径，但由于其具有实验条件要求高、操作繁琐以及处理大批量样品能力不足等局限性，因此在aivs纯化工作中的应用受到制约。鸡胚有限终点稀释法由于操作简单，对实验条件要求不高且能够平行处理大量样品而被广泛应用。但由于多种亚型的aivs在同一鸡胚中的增殖速度和竞争生长能力存在差异，往往只有某种具有竞争优势的毒株能够被纯化出来，其它亚型的aivs被掩盖或丢失，纯化的实际结果可能与初衷不符。鸡胚终点稀释结合特异性抗血清中和法具有良好的实用性，但其使用的特异性抗体血清在使用时仍有一定的交叉反应导致纯化效果不理想。aiv血凝素单克隆抗体特异性强，可以有效解决抗体血清的交叉反应问题，实现多亚型禽流感病毒混合感染中单一病毒的快速纯化。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供一种多亚型禽流感病毒混合感染中单一病毒纯化的方法，采用aiv血凝素单克隆抗体对混合感染的aivs进行纯化和鉴定，通过单克隆抗体代替血清做特异性中和实验，同时还能相对定量中和混合病毒液中的特定抗原，减少传代次数，防止病毒因多次传代造成变异。

2、为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

3、一种多亚型禽流感病毒混合感染中单一病毒纯化的方法，包含以下操作步骤：

4、(1)采用不同亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体(杂交瘤细胞)制备单克隆抗体腹水，即将不同亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞注射搭到小鼠腹腔中，收集腹水，再利用袋透析和deae-纤维柱过柱法对收集到的腹水进行纯化，即得单克隆抗体腹水；

5、(2)制备混合样品并初步鉴定，得到待测样；

6、(3)用hi测定步骤(1)制得的单克隆抗体腹水的效价，对单克隆抗体腹水做2倍倍比稀释；

7、(4)将步骤(3)2倍倍比稀释后所得单克隆抗体腹水与步骤(2)所得待测样混合，震荡混匀后37℃放20分钟，使待测样与不同稀释度的单克隆抗体中和反应；

8、(5)用终点稀释法对步骤(4)中和反应后所得反应液进行稀释，每组每管都选择10-1和10-2两个稀释度分别接种10日龄spf鸡胚各两枚，每胚接种量为0.2ml；传代收胚后用hi试验逐代检测aivs纯化效果，当发现相应尿囊液中各病毒用单抗做hi实验时的滴度高于24时，继续按上述方法添加相应步骤(3)2倍倍比稀释后所得单克隆抗体腹水进行中和，直至hi试验证明病毒已经纯化了，再稀释传代1次，即得。再用hi试验检测病毒纯化效果。

9、作为优选，步骤(1)中所述的亚型禽流感病毒为h9、h3、h6或h4亚型禽流感病毒中的一种或多种。

10、作为优选，步骤(2)中所述的制备混合样品为分别对测序验证正确的3株aiv毒株(a/chicken/guangxi/449c11/2021(h9n2)、a/duck/guangxi/438d31/2021(h6n8)、a/pigeon/guangxi/288p43/2017(h3n6)))的鸡胚半数感染量(eid50)进行测定：将病毒用四抗溶液作10倍连续稀释，接种10日龄spf鸡胚尿囊腔，每枚0.2ml，收集接种后24-120小时死亡及120小时后未死鸡胚，统计感染阳性胚，用reed-muench法计算eid50；用未接种病毒10日龄鸡胚尿囊液将3株病毒滴度分别调至106eid50；第一组分别取h9n2和h6n8各0.2ml混合均匀，第2组分别取h9n2、h6n8和h3n6各0.2ml混合均匀，两组尿囊液分别用四抗溶液作10倍连续稀释，取10-3、10-4和10-5三个稀释度分别接种10日龄spf鸡胚尿囊腔，每个稀释度接种5枚鸡胚，每胚0.2ml，分别收集接种后24-120小时死亡鸡胚及120小时未死鸡胚尿囊液(如果所有鸡胚24小时内均死亡则选取几枚收取尿囊液，下同)；选择最低稀释度的尿囊液用抗h1-h16、eds和ndv阳性血清进行血凝抑制试验(hi)，同时用rt-pcr对尿囊液中的aivs的na亚型进行鉴定，鉴定出第1组有h9n2和h6n8、第2组有h9n2、h6n8和h3n6，即分别得到第1组的人工混合样品和第2组的人工混合样品。

11、作为优选，步骤(3)中采用pbs作为稀释液，对单克隆抗体腹水稀释。

12、作为优选，步骤(3)中h9亚型按1：32、1：64、1：128、1：256的倍数稀释，h3亚型按照1：8、1：16、1：32、1：64的倍数稀释；其他亚型根据单抗腹水的hi效价进行适当稀释。

13、作为优选，步骤(4)中所述单克隆抗体腹水与步骤(2)所得待测样按照体积比1:1混合。

14、将上所述多亚型禽流感病毒混合感染中单一病毒纯化方法纯化后所得病毒进行鉴定，准确性较传统有限稀释和血清中和方法高。

15、与现有技术相比，本发明的有益效果：

16、本发明方法使单抗和病毒相对定量中和，尽量减少单抗和病毒用量，中和反应更加灵敏和准确，节约成本和纯化时间，保持了病毒原有生物特性，通过本发明纯化后得到的病毒进行检测鉴定，鉴定结果的准确性确实较单因子血清方法高；进一步的，本发明方法采用的单克隆抗体特异性强，比特异性血清(成分相对复杂)效果要好，不会发生交叉反应，加快病毒纯化速度，病毒减少传代次数，有利于保持病毒本身的生物学特性。

技术特征：

1.一种多亚型禽流感病毒混合感染中单一病毒纯化的方法，其特征在于，包含以下操作步骤：

2.根据权利要求1所述多亚型禽流感病毒混合感染中单一病毒纯化的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的亚型禽流感病毒为h9、h3、h6或h4亚型禽流感病毒中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述多亚型禽流感病毒混合感染中单一病毒纯化的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的制备混合样品为分别对测序验证正确的3株aiv毒株(a/chicken/guangxi/449c11/2021(h9n2)、a/duck/guangxi/438d31/2021(h6n8)、a/pigeon/guangxi/288p43/2017(h3n6)))的鸡胚半数感染量(eid50)进行测定：将病毒用四抗溶液作10倍连续稀释，接种10日龄spf鸡胚尿囊腔，每枚0.2ml，收集接种后24-120小时死亡及120小时后未死鸡胚，统计感染阳性胚，用reed-muench法计算eid50；用未接种病毒10日龄鸡胚尿囊液将3株病毒滴度分别调至106eid50；第一组分别取h9n2和h6n8各0.2ml混合均匀，第2组分别取h9n2、h6n8和h3n6各0.2ml混合均匀，两组尿囊液分别用四抗溶液作10倍连续稀释，取10-3、10-4和10-5三个稀释度分别接种10日龄spf鸡胚尿囊腔，每个稀释度接种5枚鸡胚，每胚0.2ml，分别收集接种后24-120小时死亡鸡胚及120小时未死鸡胚尿囊液(如果所有鸡胚24小时内均死亡则选取几枚收取尿囊液，下同)；选择最低稀释度的尿囊液用抗h1-h16、eds和ndv阳性血清进行血凝抑制试验(hi)，同时用rt-pcr对尿囊液中的aivs的na亚型进行鉴定，鉴定出第1组有h9n2和h6n8、第2组有h9n2、h6n8和h3n6，即分别得到第1组的人工混合样品和第2组的人工混合样品。

4.根据权利要求1所述多亚型禽流感病毒混合感染中单一病毒纯化的方法，其特征在于：步骤(3)中采用pbs作为稀释液，对单克隆抗体腹水稀释。

5.根据权利要求1所述多亚型禽流感病毒混合感染中单一病毒纯化的方法，其特征在于：步骤(3)中h9亚型按1：32、1：64、1：128、1：256的倍数稀释，h3亚型按照1：8、1：16、1：32、1：64的倍数稀释；其他亚型根据单抗腹水的hi效价进行适当稀释。

6.根据权利要求1所述多亚型禽流感病毒混合感染中单一病毒纯化的方法，其特征在于：步骤(4)中所述单克隆抗体腹水与步骤(2)所得待测样按照体积比1:1混合。

技术总结本发明公开了一种多亚型禽流感病毒混合感染中单一病毒纯化的方法：(1)采用亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体制备单克隆抗体腹水；(2)制备混合样品；(3)用HI测定单克隆抗体腹水的效价，对单克隆抗体腹水做稀释；(4)将2倍倍比稀释后所得单克隆抗体腹水与待测样混合，震荡混匀使待测样与不同稀释度的单克隆抗体中和反应；(5)用终点稀释法中和反应后所得反应液进行稀释、纯化，即得。本发明方法使单抗和病毒相对定量中和，尽量减少单抗和病毒用量，中和反应更加灵敏和准确，节约成本和纯化时间，保持了病毒原有生物特性，通过本发明纯化后得到的病毒进行检测鉴定，鉴定结果的准确性确实较单因子血清方法高。技术研发人员：李丹,李孟,谢芝勋,谢丽基,罗思思,谢志勤,张民秀,王盛,李小凤,张艳芳,曾婷婷受保护的技术使用者：广西壮族自治区兽医研究所技术研发日：技术公布日：2024/11/14