靶向CLEC2D的CAR及其应用

本发明属于生物，具体涉及靶向clec2d的car及其应用。

背景技术：

1、嵌合抗原受体（car）是一种通过基因工程技术将两种或多种不同抗原特异性受体或其片段融合在一起，形成的新型受体。尽管car技术在t细胞治疗中已经取得了显著的进展，但针对nk细胞的car结构改造研究相对较少。这主要是因为nk细胞与t细胞在生物学特性和功能上存在显著差异，例如，nk细胞的活化机制和信号转导途径与t细胞不同，因此针对nk细胞的car结构改造需要克服更多的技术难题。并且，相比t细胞，将nk细胞作为car（嵌合抗原受体）的宿主细胞具有显著的好处。nk细胞天然具备强大的抗肿瘤活性和更广泛的组织浸润能力，无需事先致敏即可直接杀伤多种肿瘤细胞，且不易引发移植物抗宿主病。将car技术引入nk细胞，不仅保留了其强大的免疫杀伤能力，还通过car的精准靶向性增强了其对特定肿瘤抗原的识别与攻击，从而提高了治疗的特异性和有效性。此外，nk细胞可能引发的免疫反应较t细胞温和，有助于降低治疗过程中的严重副作用风险。因此，car-nk细胞疗法在抗肿瘤治疗中展现出巨大潜力，为患者提供了更加安全、有效的治疗选择。

2、现有技术中，以cd19为靶点，利用car-nk细胞来定向清除cd19+肿瘤细胞已在非实体瘤的急性淋巴细胞白血病（all）的治疗中表现出较好防治效果。但是car-nk技术在实体瘤中的应用目前尚不尽人意，还有许多问题需要解决，其中一个重要技术问题就是寻找在实体肿瘤中特异表达的靶点抗原。

3、针对细胞表面表达分子相关研究表明，clec2d作为一种免疫球蛋白样粘附分子，其参与了细胞运动、自然杀伤和nk细胞以及nk细胞介导的免疫过程。clec2d通过与cd161相互作用在免疫中发挥重要作用。已有研究表明，clec2d在人的各种正常组织中很少或弱表达，但在多种人类恶性肿瘤中存在过度表达现象，对肿瘤的增殖转移有明显的促进作用，并与患者不良预后相关。例如，clec2d在乳腺癌中的大量表达等等。基于这一特点，将clec2d作为目标靶点，进而开发一种car-nk细胞治疗方法，则有望拓展car-nk技术在实体瘤治疗中的应用范围以及进一步改善肿瘤的治疗效果是具有十分重要的技术意义的。

4、其次，牛磺酸是一种含硫氨基酸，在动物体内以游离形式存在，但不参与蛋白质合成。有研究表明，牛磺酸可促进t细胞和b细胞增殖，并增强t细胞免疫功能。目前尚无牛磺酸影响nk细胞特性的报道，且业界内尚无牛磺酸联合靶向clec2d抗原的car-nk淋巴细胞来制备抗肿瘤药物的报道。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明旨在提供靶向clec2d的car及其应用，具体涉及一种靶向clec2d的car（嵌合抗原受体）及其应用。将本发明提供的car应用于nk细胞得到car-nk细胞，其与牛磺酸联用能够产生协同增效的作用，进一步提高car-nk细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。

2、为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明的第一个目的是提供一种靶向clec2d的car，所述car由人cd8a分子信号肽、人源cd161胞外区、人cd8a分子柔性片段、人cd28分子跨膜区与胞内区、人cd3z分子胞内区依次串联构成；或所述car由人cd8a分子信号肽、人源cd161胞外区、人cd8a分子柔性片段、人41bb分子跨膜区与胞内区、人cd3z分子胞内区依次串联构成。

4、优选的，编码所述car的氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示；所述人cd8a分子信号肽的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述人源cd161胞外区的氨基酸序列如seq id no.4所示；所述人cd8a分子柔性片段的氨基酸序列如seq id no.5所示；所述人cd28分子跨膜区与胞内区的氨基酸序列如seq id no.6所示；所述人41bb分子跨膜区与胞内区的氨基酸序列如seq id no.7所示；所述人cd3z分子胞内区的氨基酸序列如seq idno.8所示。

5、malpvtalllplalllhaarpqkssiekcsvdiqqsrnktterpgllncpiywqqlrekcllfshtvnpwnnsladcstkesslllirdkdelihtqnlirdkailfwiglnfslseknwkwingsflnsndleirgdakenscisisqtsvyseycsteirwicqkeltpvrnkvypdstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（seq id no.1）；

6、malpvtalllplalllhaarpqkssiekcsvdiqqsrnktterpgllncpiywqqlrekcllfshtvnpwnnsladcstkesslllirdkdelihtqnlirdkailfwiglnfslseknwkwingsflnsndleirgdakenscisisqtsvyseycsteirwicqkeltpvrnkvypdstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（seq id no.2）；

7、malpvtalllplalllhaarp（seq id no.3）；

8、qkssiekcsvdiqqsrnktterpgllncpiywqqlrekcllfshtvnpwnnsladcstkesslllirdkdelihtqnlirdkailfwiglnfslseknwkwingsflnsndleirgdakenscisisqtsvyseycsteirwicqkeltpvrnkvypds（seq id no.4）；

9、tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd（seq id no.5）；

10、fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs（seq id no.6）；

11、krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel（seq id no.7）；

12、rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（seq id no.8）。

13、本发明的第二个目的是提供一种核酸分子，所述核酸分子包含编码上述的car的核苷酸序列。

14、优选的，所述编码上述的car的核苷酸序列如seq id no.9或seq id no.10所示。

15、atggcgctgccggtgaccgcgctgctgctgccgctggcgctgctgctgcatgcggcgcgcccgcagaaaagcagcattgaaaaatgcagcgtggatattcagcagagccgcaacaaaaccaccgaacgcccgggcctgctgaactgcccgatttattggcagcagctgcgcgaaaaatgcctgctgtttagccataccgtgaacccgtggaacaacagcctggcggattgcagcaccaaagaaagcagcctgctgctgattcgcgataaagatgaactgattcatacccagaacctgattcgcgataaagcgattctgttttggattggcctgaactttagcctgagcgaaaaaaactggaaatggattaacggcagctttctgaacagcaacgatctggaaattcgcggcgatgcgaaagaaaacagctgcattagcattagccagaccagcgtgtatagcgaatattgcagcaccgaaattcgctggatttgccagaaagaactgaccccggtgcgcaacaaagtgtatccggatagcaccaccaccccggcgccgcgcccgccgaccccggcgccgaccattgcgagccagccgctgagcctgcgcccggaagcgtgccgcccggcggcgggcggcgcggtgcatacccgcggcctggattttgcgtgcgatttttgggtgctggtggtggtgggcggcgtgctggcgtgctatagcctgctggtgaccgtggcgtttattattttttgggtgcgcagcaaacgcagccgcctgctgcatagcgattatatgaacatgaccccgcgccgcccgggcccgacccgcaaacattatcagccgtatgcgccgccgcgcgattttgcggcgtatcgcagccgcgtgaaatttagccgcagcgcggatgcgccggcgtatcagcagggccagaaccagctgtataacgaactgaacctgggccgccgcgaagaatatgatgtgctggataaacgccgcggccgcgatccggaaatgggcggcaaaccgcagcgccgcaaaaacccgcaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagataaaatggcggaagcgtatagcgaaattggcatgaaaggcgaacgccgccgcggcaaaggccatgatggcctgtatcagggcctgagcaccgcgaccaaagatacctatgatgcgctgcatatgcaggcgctgccgccgcgc（seqidno.9）；

16、atggcgctgccggtgaccgcgctgctgctgccgctggcgctgctgctgcatgcggcgcgcccgcagaaaagcagcattgaaaaatgcagcgtggatattcagcagagccgcaacaaaaccaccgaacgcccgggcctgctgaactgcccgatttattggcagcagctgcgcgaaaaatgcctgctgtttagccataccgtgaacccgtggaacaacagcctggcggattgcagcaccaaagaaagcagcctgctgctgattcgcgataaagatgaactgattcatacccagaacctgattcgcgataaagcgattctgttttggattggcctgaactttagcctgagcgaaaaaaactggaaatggattaacggcagctttctgaacagcaacgatctggaaattcgcggcgatgcgaaagaaaacagctgcattagcattagccagaccagcgtgtatagcgaatattgcagcaccgaaattcgctggatttgccagaaagaactgaccccggtgcgcaacaaagtgtatccggatagcaccaccaccccggcgccgcgcccgccgaccccggcgccgaccattgcgagccagccgctgagcctgcgcccggaagcgtgccgcccggcggcgggcggcgcggtgcatacccgcggcctggattttgcgtgcgataaacgcggccgcaaaaaactgctgtatatttttaaacagccgtttatgcgcccggtgcagaccacccaggaagaagatggctgcagctgccgctttccggaagaagaagaaggcggctgcgaactgcgcgtgaaatttagccgcagcgcggatgcgccggcgtatcagcagggccagaaccagctgtataacgaactgaacctgggccgccgcgaagaatatgatgtgctggataaacgccgcggccgcgatccggaaatgggcggcaaaccgcagcgccgcaaaaacccgcaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagataaaatggcggaagcgtatagcgaaattggcatgaaaggcgaacgccgccgcggcaaaggccatgatggcctgtatcagggcctgagcaccgcgaccaaagatacctatgatgcgctgcatatgcaggcgctgccgccgcgc（seq id no.10）。

17、本发明的另一个目的是提供一种载体，所述载体包括上述的核酸分子。

18、优选的，所述载体为含有所述核酸分子的慢病毒。

19、本发明的另一个目的是提供一种基因工程改造的nk细胞，所述nk细胞表达特异性识别clec2d的如上述的car。

20、本发明的另一个目的是提供上述的car或者核酸分子或者载体或者nk细胞在制备治疗表达clec2d肿瘤的药物组合物中的应用。

21、优选的，所述肿瘤包括胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌、前列腺癌、肺癌和肝癌。

22、本发明的另一个目的是提供上述nk细胞与牛磺酸联用在制备治疗肿瘤药物中的应用，所述牛磺酸的cas号为107-35-7，分子式c2h7no3s；所述肿瘤表达clec2d。

23、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

24、（1）本发明首次以clec2d作为靶点，提供了一种靶向clec2d的car。本发明提供的car对于clec2d具有特异性，其在nk细胞上表达之后所得到的car-nk细胞针对clec2d靶点具有特异识别性，该car-nk细胞可以靶向clec2d抗原从而治疗表达clec2d的肿瘤，包括胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌、前列腺癌、肺癌和肝癌等。

25、（2）本发明还进一步将牛磺酸与本发明靶向clec2d抗原的car-nk细胞进行联用，发现其能发挥协同作用，进一步提高car-nk细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。