一种肿瘤特异性生长因子检测试剂、试剂盒及用途的制作方法

本发明属于免疫学分析检测领域，尤其涉及一种肿瘤特异性生长因子检测试剂、含有该检测试剂的试剂盒及该检测试剂在制备检测肿瘤的试剂盒中的用途。

背景技术：

1、肿瘤特异性生长因子(tsgf)属于非血细胞生长因子大类，相对分子质量不大，是数种国际公认的与恶性肿瘤生长相关的糖类物质和代谢物的统称，此类物质包括上皮生长因子(epidermal growth factor，egf)、神经细胞生长因子(nerve growth factor，ngf)、肝细胞生长因子(hepatocyte growthfactor，hgf)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、血管内皮生长因子(vegf)、血小板衍生生长因子(pdgf)、转化生长因子α和β(tgf-α、tgf-β)，人骨骼生长因子(hsgf)以及促血管生成素(ang)等。

2、tsgf是肿瘤细胞分泌的标志性因子，与肿瘤生长及血管生存有关。齐发梅、魏莲花等人研究发现，tsgf在肠道恶性肿瘤诊断灵敏度为80.00％，胃部恶性肿瘤诊断灵敏度为76.19％、肺部恶性肿瘤诊断灵敏度为82.65％，肝癌及肝硬化诊断灵敏度为96.55％、胆管癌诊断灵敏度为71.43％，卵巢癌诊断灵敏度为52.59％。tsgf因肿瘤谱广，灵敏度高等而成为目前广泛应用的肿瘤筛选及复发监测指标。

3、tsgf对监测肿瘤的生长及复发有一定价值。但是，目前常见的tsgf测定试剂盒存在灵敏度低、准确度低、线性范围窄、特异性差无法满足临床应用要求的问题。

技术实现思路

1、本发明提供一种肿瘤特异性生长因子检测试剂，能够提高tsgf检测体系的灵敏度和特异性。

2、为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种肿瘤特异性生长因子检测试剂，包括：

4、第一抗体，第一抗体包括以下抗体中的至少两种：egf、ngf、tgf-α、tgf-β、hgf、bfgf和/或pdgf，且上述抗体的摩尔比为(1-2)∶(1-2)∶(1-2)∶(1-2)∶(1-2)∶(1-2)∶(1-2)；所述第一抗体的浓度为0.3-10μg/ml。

5、在一些实施例中，第一抗体包括以下抗体中的至少三种：egf、ngf、tgf-α、tgf-β、hgf、bfgf和/或pdgf。

6、在一些实施例中，第一抗体包括以下抗体中的至少四种：egf、ngf、tgf-α、tgf-β、hgf、bfgf和/或pdgf。

7、在一些实施例中，第一抗体包括以下抗体中的至少五种：egf、ngf、tgf-α、tgf-β、hgf、bfgf和/或pdgf。

8、在一些实施例中，第一抗体包括以下抗体中的至少六种：egf、ngf、tgf-α、tgf-β、hgf、bfgf和/或pdgf。

9、在一些实施例中，第一抗体由egf、ngf、tgf-α、tgf-β、hgf、bfgf及pdgf组成。

10、在一些实施例中，第一抗体由egf、ngf、tgf-β、hgf、bfgf和pdgf组成。

11、第二方面，本发明提供一种肿瘤特异性生长因子检测试剂盒，包括：

12、第一试剂，包括固相载体和上述的检测试剂，检测试剂中的第一抗体包被固相载体形成固相载体包被物，所述固相载体包被物浓度为0.08-0.4mg/ml；

13、第二试剂，包括第二抗体，所述第二抗体的成分与所述第一抗体的成分相同，所述第二抗体的浓度为0.04-0.3μg/ml，所述第二抗体上标记有化学发光剂。

14、在一些实施例中，固相载体包括磁性纳米颗粒、金纳米颗粒或微孔板中的一种或多种组合。优选的，固相载体选择磁性纳米颗粒。

15、进一步地，所述磁性纳米颗粒为超顺磁性纳米微球，所述超顺磁性纳米微球粒径为1000nm-3000nm。

16、在一些实施例中，第一试剂还包括固相载体稀释液，固相载体包被物与固相载体稀释液的体积比为1:50-1:10。

17、在一些实施例中，固相载体稀释液为磁性纳米颗粒稀释液，所述磁性纳米颗粒稀释液包括0.02m-0.1m磷酸盐缓冲液、0.5％-10％的蛋白稳定剂和0.01-0.5％表面活性剂；所述磷酸盐缓冲液的ph值为6.8-7.4；所述蛋白稳定剂为牛血清白蛋白、小牛血清、山羊血清、酪蛋白、蔗糖、海藻糖中一种或多种组合；所述表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通x-100、s9中一种或多种组合。

18、在一些实施例中，检测试剂盒还包括校准品和质控品，校准品由所述第一抗体对应的抗原成分稀释得到，质控品由所述第一抗体对应的抗原成分稀释得到。

19、在一些实施例中，所述校准品稀释液包括0.01m-0.1m磷酸盐缓冲液、0.5％-10％稳定剂和0.01％-0.5％表面活性剂；所述稳定剂为牛血清白蛋白、小牛血清、山羊血清、酪蛋白、蔗糖、海藻糖中的一种或多种组合；所述表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通x-100、s9中的一种或多种组合。

20、在一些实施例中，所述校准品和质控品中抗原成分的浓度为0.1～300ng/ml。

21、在一些实施例中，化学发光剂包括吖啶酯、吖啶酯衍生物、三联吡啶钌、鲁米诺、鲁米诺衍生物、异鲁米诺、amppd、草酸酯、过氧草酸酯类化合物、二氧杂环丁烷或二氧杂环丁烷类化合物中的任一种。

22、在一些实施例中，化学发光剂包括吖啶酯。

23、进一步的，检测试剂盒还包括激发剂，激发剂包括激发液a和激发液b，激发液a包括h2o2、乙醇和吐温20，激发液b包括氢氧化钠、乙醇和曲拉通x-100。

24、在一些实施例中，第二试剂还包括化学发光剂稀释液，标记有化学发光剂第二抗体与化学发光剂稀释液的体积比为1:500-1:200。

25、在一些实施例中，化学发光剂稀释液为吖啶酯稀释液，吖啶酯稀释液包括0.02m-0.1m tris缓冲液、0.5％-10％稳定剂和0.01％-0.5％表面活性剂；所述稳定剂为牛血清白蛋白、小牛血清、山羊血清、酪蛋白、蔗糖、海藻糖中的一种或多种组合；所述表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通x-100、s9中的一种或多种组合。

26、第三方面，本发明提供一种肿瘤特异性生长因子检测试剂盒的制备方法，包括：磁性纳米颗粒包被的第一抗体的制备方法和吖啶酯标记的第二抗体的制备方法。

27、所述磁性纳米颗粒包被的第一抗体的制备方法，包括以下步骤：

28、(a)获得磁性纳米颗粒；(b)使用磁性纳米颗粒单独包被第一抗体的各个抗体(c)混合多种第一抗体包被的磁性纳米颗粒包被物。

29、所述吖啶酯标记的第二抗体的制备方法，包括以下步骤：

30、(a)使用吖啶酯单独标记第二抗体的各个抗体；(b)加入吖啶酯终止缓冲液终止标记；(c)透析完成后混合带有吖啶酯标记的多种第二抗体。

31、在一些实施例中，所述磁性纳米颗粒包被的第一抗体的制备方法，包括以下步骤：

32、(1)用包被缓冲液清洗磁性纳米颗粒，并用磁铁富集，吸去反应液后用包被缓冲液再次进行清洗；

33、(2)清洗后的磁性纳米颗粒依次加入包被缓冲液，活化剂1和活化剂2，混匀后放入混匀仪中室温活化30min；反应完成后用磁铁富集，吸去反应液后用包被缓冲液清洗2次；

34、(3)加入包被缓冲液重悬，然后加入所需量的egf、ngf、tgf-α、tgf-β、hgf、bfgf、pdgf中的多种抗体，放入混匀仪中室温包被3h；

35、(4)用磁铁对上述产物重新富集，吸去反应液后用包被缓冲液清洗3次，加入封闭剂放入混匀仪中置于室温封闭2h；

36、(5)用磁铁将步骤(4)得到的产物重新富集，吸去反应液后用包被缓冲液清洗3次，加入磁珠稀释液，得到磁珠包被物。

37、(6)将多种抗体包被的磁珠包被物以一定的比例混合。

38、在一些实施例中，活化剂1为edc，活化剂2为s-nhs。

39、在一些实施例中，所述包被缓冲液为mes缓冲液，ph值为4.0-6.0。

40、在一些实施例中，所述封闭剂包括磷酸盐缓冲液、0.5-2％牛血清白蛋白和0.02-0.2％防腐剂。

41、在一些实施例中，多种抗体包被物的混合比例为(1-2):(1-2):(1-2):(1-2):(1-2):(1-2):(1-2)。

42、在一些实施例中，所述吖啶酯标记物的制备方法，包括以下步骤：

43、(1)取吖啶酯标记缓冲液、egf、ngf、tgf-α、tgf-β、hgf、bfgf、pdgf单克隆抗体和吖啶酯母液，混合均匀后在室温避光下进行标记反应；

44、(2)待标记反应后得到吖啶酯结合物，在吖啶酯结合物中加入吖啶酯终止缓冲液，混合均匀后在室温下避光反应；

45、(3)采用吖啶酯透析缓冲液对步骤(2)的反应产物进行透析；

46、(4)透析完成后，往反应产物中加入甘油和保护剂，混匀至均相，得到吖啶酯标记物；

47、(5)将多种抗体标记的吖啶酯包被物以一定的比例混合。

48、在一些实施例中，所述吖啶酯终止缓冲液包括0.02m-0.1m缓冲溶液、0.05-0.2m无机盐和0.5-2％氨基酸；所述缓冲溶液为ph值7.0-9.0的pb缓冲溶液；所述氨基酸为赖氨酸、甘氨酸或丙氨酸中的一种或多种组合。

49、在一些实施例中，多种抗体标记的吖啶酯包被物比例为(1-2):(1-2):(1-2):(1-2):(1-2):(1-2):(1-2)。

50、第四方面，本发明提供一种化学发光免疫检测方法，包括以下步骤：

51、测试校准品，制作主曲线；

52、用校准品校准全自动化学免疫分析仪，得到校准曲线；

53、测试质控品，测试值在规定的靶值范围内则可进行样本测试；

54、仪器取待测样本，采用上述的试剂盒进行免疫反应，加入激发液，进入全自动免疫检验系统，测定发光信号，经由校准曲线得出样本中肿瘤特异性生长因子的浓度。

55、进一步地，上述的试剂盒的发光剂为吖啶酯，此时激发剂包括激发液a和激发液b；所述激发液a包括h2o2、乙醇和吐温20，所述激发液b包括氢氧化钠、乙醇和曲拉通x-100。

56、在一些实施例中，上述溶液还包括：0.02-0.2％防腐剂。

57、防腐剂的添加可以防止微生物繁殖对试剂盒品质带来不良影响，凡是能抑制微生物生长的物质均可作为本发明的防腐剂。优先地，防腐剂采用bnd、proclin300中的一种或两种组合。

58、本发明加入稳定剂的作用是保护抗体/抗原活性，同时增加试剂盒中各组分的稳定性，延长产品有效期。

59、本发明加入表面活性剂的作用是促进试剂盒体系中各组分以及检测样本中各个物质的均匀分散以及提高检测精密度，确保结果可重现性。

60、第五方面，本发明提供上述的检测试剂在制备用于检测肿瘤的试剂盒中的用途。

61、与现有技术相比，本发明所能达到的技术效果包括：

62、本发明的检测试剂采用多抗体组合，由于tsgf是肿瘤细胞产生的一种多肽类物质，与肿瘤生长及血管生存有关，多抗体组合检测可以提升肿瘤检出率，即能够提高检测体系的灵敏度；本发明的检测试剂盒具有分析灵敏度高、线性范围宽及准确度高的优点，具有更优检测性能；同时本发明的化学发光免疫检测方法选取的抗体对肿瘤的特异性较好，因而检测体系特异性好，可替代现有的检测方法，契合临床检测需求。