一种基于分散液液微萃取技术检测医疗器械浸提液中不挥发性未知物含量的方法与流程

本发明涉及物质分析检测，特别是涉及一种基于分散液液微萃取技术检测医疗器械浸提液中不挥发性未知物含量的方法。

背景技术：

1、可沥滤物是在医疗器械产品与人体不断接触并发挥作用的过程中，或与使用中的其他介质(如药液、血液等)相互作用时，从医疗器械中释放的化学物质，一般包括灭菌残留剂、加工工艺残留、降解产物、溶剂、材料中的单体及添加剂(包括稳定剂、抗氧化剂、增塑剂、着色剂等)等。在医疗器械发挥诊疗作用的同时，可沥滤物也在或短期或长期地对人体产生安全性方面的危害。因此，对其安全性的研究既是企业在设计开发产品阶段需要重点关注内容，也是相关产品技术审评的关注重点。

2、在可沥滤物检测实践中，面临多种实际挑战，如临床接触途径及使用方法多样且复杂、临床样本采集的伦理问题等，对与大部分器械来说，难以进行可沥滤物的真正意义上的研究，而更适宜通过浸提实验替代可沥滤物研究。

3、近年来，对于医疗器械浸提液中可浸提物和可沥滤物含量的分析检测方法为：使用不同极性的溶剂对医疗器械产品进行浸提，所得到的浸提液需要进行溶剂置换，氮吹浓缩后进行上机分析。该方法存在以下不足：首先，对于水或乙醇水等水基质样品浸提液，需要进行溶剂置换，通常采用二氯甲烷，使得二氯甲烷溶剂使用量大，成本提升，且需要振摇后进行氮吹浓缩等步骤，耗时长，费时费力；其次，对于浓缩倍数较高的研究项目，所需要的样品浸提液也就越多，也需要更多数量的样品进行浸提，而医疗器械产品价格昂贵，这将大大提升研究成本。而对于可沥滤物中的不挥发性未知物含量的检测，如何设置液相色谱串联质谱的检测条件以实现更精确的检测结果，也是需要解决的问题之一。

4、因此，本领域需要研究一种能够基于分散液液微萃取技术检测医疗器械浸提液中不挥发性未知物含量的方法，降低有机溶剂使用量并缩短操作时间，大大降低试验成本，从而提升检测效率，也进一步满足科研与市场的需求。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本技术提供一种基于分散液液微萃取技术检测医疗器械浸提液中不挥发性未知物含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2、步骤1、配制内标溶液，所述内标溶液包括邻苯二甲酸二己酯-d4、邻苯二甲酸二异癸酯-d4和三氯生-d3；

3、步骤2、配制抗氧剂1098系列标准工作溶液，所述抗氧剂1098系列标准工作溶液包括抗氧剂1098、己二酸二(2-乙基己基)酯、抗氧剂1076、偏苯三甲酸三辛酯、抗氧剂1010、双酚a、对羟基苯甲酸甲酯、十二内酰胺、邻苯二甲酸二正辛酯、3,3-硫代二丙酸二月桂酯、柠檬酸三乙酯、油酸酰胺、二十四烷酸、邻苯二甲酸二己酯-d4、邻苯二甲酸二异癸酯-d4和三氯生-d3；

4、步骤3、配制萃取剂和助溶剂，所述萃取剂为二氯甲烷与异丙醇的混合溶液，所述助溶剂为乙醇水溶液；

5、步骤4、取样品浸提液，加入步骤1配制的内标溶液，再加入水或助溶剂，混匀；

6、步骤5、快速注入萃取剂，离心并取出下层有机溶剂置于氮吹管，重复前述萃取操作2次，将所有下层有机相合并至同一个氮吹管中，氮吹浓缩得到待测样品液；

7、步骤6、使用液相色谱质谱联用仪检测抗氧剂1098系列标准工作溶液及待测样品液，采用内标法建立校准曲线；

8、步骤7、获得待测样品液中未知物峰面积，进行定性和定量，结合校准曲线得到未知物浓度；

9、步骤8、根据未知物浓度计算未知物含量，计算公式如下：

10、

11、式中：

12、c：未知物浓度；

13、v：浸提液体积；

14、n：浸提的医疗器械数量；

15、f：浓缩倍数。

16、具体地，所述内标混标溶液中，邻苯二甲酸二己酯-d4、邻苯二甲酸二异癸酯-d4和三氯生-d3的浓度均为100μg/ml。

17、具体地，所述抗氧剂1098系列标准工作溶液中，抗氧剂1098、己二酸二(2-乙基己基)酯、抗氧剂1076、偏苯三甲酸三辛酯、抗氧剂1010、双酚a、对羟基苯甲酸甲酯、十二内酰胺、邻苯二甲酸二正辛酯、3,3-硫代二丙酸二月桂酯、柠檬酸三乙酯、油酸酰胺和二十四烷酸的浓度梯度设置为0.1μg/ml～1.0μg/ml，邻苯二甲酸二己酯-d4、邻苯二甲酸二异癸酯-d4和三氯生-d3的浓度均为0.5μg/ml。

18、具体地，所述抗氧剂1098系列标准工作溶液中，抗氧剂1098、己二酸二(2-乙基己基)酯、抗氧剂1076、偏苯三甲酸三辛酯、抗氧剂1010、双酚a、对羟基苯甲酸甲酯、十二内酰胺、邻苯二甲酸二正辛酯、3,3-硫代二丙酸二月桂酯、柠檬酸三乙酯、油酸酰胺和二十四烷酸的工作液浓度分别为0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml、0.8μg/ml和1.0μg/ml。

19、具体地，所述萃取剂中，二氯甲烷和异丙醇的体积比为1:1～1:3，所述助溶剂中，乙醇和水的体积比为1:4～1:6。

20、优选地，所述萃取剂中，二氯甲烷和异丙醇的体积比为1:2，所述助溶剂中，乙醇和水的体积比为1:5。

21、具体地，样品浸提液、助溶剂和萃取剂的用量比为5:15:1。

22、具体地，所述步骤5中，离心的条件为：1000r/min离心1min。

23、具体地，所述步骤4中，所述加入水或助溶剂是指，当样品浸提液由50％乙醇水作为浸提溶剂对医疗器械产品进行浸提后所得时，加入水；当样品浸提液由水作为浸提溶剂对医疗器械产品进行浸提后所得时，加入助溶剂；水的加入量和助溶剂的加入量相同。

24、具体地，所述步骤6中，所述液相色谱质谱联用仪的液相色谱条件为：色谱柱：zorbax sb-c18 2.1×100mm，1.8μm；进样体积为正模式中0.5μl，负模式中3μl；柱温为40℃；流速为0.4ml/min；洗脱方式为梯度洗脱；采用正离子模式时，流动相a为甲酸水溶液，流动相b为甲醇溶液；采用负离子模式时，流动相a为乙酸铵水溶液，流动相b为甲醇溶液。

25、具体地，所述步骤6中，所述气相色谱质谱联用仪的高分辨率质谱条件为：离子源为电喷雾离子源；干燥气温度为350℃，干燥气流速为10l/min，鞘气温度为375℃，鞘气流速为11l/min，ms扫描速率为5.00spectra/sec，ms/ms扫描速率为5.00spectra/sec，扫描范围为80-1700amu，fragmentor电压为正模式中75，负模式中125。

26、具体地，所述校准曲线中各化合物对应内标为：正模式中，柠檬酸三乙酯、十二内酰胺、抗氧剂1098、油酸酰胺、己二酸二(2-乙基己基)酯和邻苯二甲酸二正辛酯的对应内标为邻苯二甲酸二己酯-d4，偏苯三甲酸三辛酯、3，3-硫代二丙酸二月桂酯和抗氧剂1076的对应内标为邻苯二甲酸二异癸酯-d4；负模式中，对羟基苯甲酸甲酯、双酚a、二十四烷酸、抗氧剂1010和抗氧剂1076的对应内标为三氯生-d3。

27、本发明的样品前处理方法具有以下有益效果：

28、1、本发明提供的基于分散液液微萃取技术检测医疗器械浸提液中不挥发性未知物含量的方法，以邻苯二甲酸二己酯-d4、邻苯二甲酸二异癸酯-d4、三氯生-d3作为内标，结合抗氧剂1098系列标准工作溶液，采用分散液液微萃取(dllme)技术，实现了对医疗器械浸提液中不挥发性未知物含量的定性定量检测，检测整体速度快，准确度高。分散液液微萃取技术相较现有传统的液液萃取方式而言，更加高效便捷，萃取溶剂的用量极少，萃取时间更短，此外，相同浓缩倍数所需要用到的样品浸提液体积也大大减少，从而减少了用于浸提的样品数量，既能显著降低医疗器械浸提液中不挥发性未知物的检测成本，同时也极大降低了医疗器械的浸提成本。

29、2、本发明提供的基于分散液液微萃取技术检测医疗器械浸提液中不挥发性未知物含量的方法，对于0.5ml样品浸提液，氮吹浓缩至0.125ml所需的时间极短，耗时短，实验效率提高的同时，避免了氮吹时间过长导致的未知物含量的损失。