一种蛋白核小球藻蛋白的制备工艺的制作方法

本发明属于藻类蛋白的提取制备，具体涉及一种蛋白核小球藻蛋白的制备工艺。

背景技术：

1、藻类是地球生态的重要组成部分，地球上已知的藻类有3万余种。自上世纪以来，藻类被认为是应对人口增长所带来的食物与蛋白质匮乏的最具潜力的对象。在世界范围内，已获得审批具有食品资质的藻类仅是少数。目前在我国共有9类与微藻相关的食品原料获得审批，其中包括蛋白核小球藻(chlorella pyrenoidosa)，蛋白核小球藻是绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，是一种球形单细胞淡水藻类，是一种高效的光合植物，以光合自养生长繁殖，分布极广。

2、蛋白核小球藻含有丰富的蛋白质、维生素、矿物质、食物纤维、核酸及叶绿素等。在食品领域被广泛应用于制作保健品、食品添加剂、饮料等。此外，蛋白核小球藻还具有出色的免疫调节作用、抗氧化能力以及降血糖和降血脂作用，被联合国粮食及农业组织(fao)评为“绿色健康食品”。目前，蛋白核小球藻作为一种营养完整的食品被商业化，具有很大的商业价值，是一种未来极具开发潜质的新型蛋白质资源。

3、蛋白核小球藻的细胞壁坚硬，如何解决破壁问题，提升蛋白溶出率，是实现蛋白核小球藻市场化应用的首要问题。而且，蛋白核小球藻的蛋白中近六成属于不溶性蛋白，在水性体系中分散能力弱，难以作为乳化剂、发泡剂等，极大限制了蛋白核小球藻蛋白在食品领域的应用。因此，找出有效的蛋白改性方法，提高蛋白核小球藻蛋白的可溶性、乳化性等，解决目前蛋白核小球藻的蛋白功能局限性，将其更多的应用于食品加工领域至关重要。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供一种蛋白核小球藻蛋白的制备工艺，采用超声辅助提取蛋白核小球藻蛋白，蛋白溶出率大幅度提高，且制备的蛋白核小球藻蛋白的溶解度、持水性、表面疏水性、乳化性和乳化稳定性都显著提升。

2、本发明具体是通过以下技术方案来实现的，依据本发明提出的一种改性裸藻多糖的制备方法，包括以下步骤：

3、(1)制备种子液：称取一定量市售bg11培养基，加入蒸馏水溶解，于121℃高压灭菌后，按照体积百分数为1％的接种量向其中接种纯化后的蛋白核小球藻(chlorellapyrenoidosa.fachb-5)藻种(由中国科学院水生生物研究所淡水藻种库购得)，将混合液置于恒温培养摇床培养，培养温度25-30℃，摇床转速90-150r/min，培养时间5d，得到种子液；

4、该步骤中所述的bg11培养基可以是产自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，产品编号为hbb793。使用时，取bg11培养基1.70g，溶解于1000ml蒸馏水中(也可以按此比例扩大配制量或减小配制量)，于121℃高压灭菌15min，备用。

5、(2)制备二级种子液：称取一定量市售bg11培养基(来源及配制方法同步骤(1))和一定量葡萄糖，将两者混合在一起，加入适量蒸馏水溶解，使得到的溶液a中葡萄糖的浓度为6-21g/l，调节溶液a的ph值至6-7，于121℃高压灭菌后冷却至室温，向其中接入步骤(1)制备的种子液，然后置于恒温培养摇床培养，培养温度25-30℃，摇床转速90-150r/min，培养时间5-7d，得到二级种子液；

6、较佳地，该步骤中种子液接种体积占溶液a体积的10％。

7、(3)制备蛋白核小球藻藻液：称取一定量市售bg11培养基(来源及配制方法同步骤(1))和一定量葡萄糖，将两者混合在一起，加入适量蒸馏水溶解，使得到的溶液b中葡萄糖的浓度为6-21g/l，调节溶液b的ph值至6-7，于121℃高压灭菌后冷却至室温，得到发酵培养基，将其加入全自动机械搅拌玻璃发酵罐(gbjl-10l)中，再将培养好的二级种子液按照体积百分数为10％的接种量接种于所述玻璃发酵罐中进行培养，培养温度28-30℃，搅拌速度100～200r/min，培养过程中流加质量分数为20％氨水控制培养液ph为6.8±0.2，发酵时间2d，得到蛋白核小球藻藻液；

8、该步骤中，氨水不仅可以维持培养液的ph，还提供氮源。

9、(4)制备藻粉：将步骤(3)制备的蛋白核小球藻藻液用80～100目滤网过滤，收集沉淀并平铺于80℃烘箱中，烘干，得藻粉；

10、(5)制备蛋白液：取一定量步骤(4)制备的藻粉，按照料液比1:(40～80)(藻粉质量与蒸馏水质量比值)向其中添加蒸馏水，并加入适量naoh溶液，使混合体系中氢氧化钠的质量分数为5～20％，室温静置4h，用1mol/l盐酸调节混合体系的ph为6.8，再向混合体系中加入中性蛋白酶(8×105u/g)，使混合体系中中性蛋白酶的质量分数为1～3％，于30-65℃水浴20～60min，随后进行超声细胞破碎，超声功率为400-500w，超声时间10-20min。超声细胞破碎之后，用naoh溶液调节细胞破碎液的ph为10.0并在此条件下保持10min，将酶灭活；再于4000r/min离心10～15min，取上清液；

11、(6)制备粗蛋白：将步骤(5)制备的上清液用等电点法沉淀，得粗蛋白。具体包括：利用质量分数为10％～30％的盐酸将步骤(5)得到的上清液ph调至3.9～4.1，静置20min后在8000r/min下离心6min，所得沉淀于-60℃下冷冻干燥24h，得到粗蛋白；

12、(7)制备纯化蛋白：将步骤(6)得到的粗蛋白溶于水中，制成浓度为10mg/ml的蛋白液，上样至deae-52纤维素层析柱并进行梯度洗脱。洗脱液分别为含nacl浓度为0、0.2mol/l、0.4mol/l、0.6mol/l、0.8mol/l的ph为8.0的tris-hcl缓冲液，洗脱速度为2ml/min，每支收集管收集12ml洗脱液，每个浓度收集48支收集管。将洗脱液合并并放入md55(8000-14000d)透析袋中用peg20000进行浓缩后，冷冻干燥，得到纯化蛋白核小球藻蛋白。

13、优选地，步骤(2)的溶液a中葡萄糖的浓度为12g/l，步骤(3)的溶液b中葡萄糖的浓度为12g/l。

14、优选地，步骤(4)蛋白核小球藻藻液用80目滤网过滤。

15、优选地，步骤(5)的料液比为1:50，混合体系中氢氧化钠的质量分数为15％，混合体系中中性蛋白酶的质量分数为1.5％，水浴温度为60℃，时间为40min，超声功率为450w，超声时间15min。

16、本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果。借由上述技术方案，本发明可达到相当的技术进步性及实用性，并具有广泛的利用价值，其至少具有下列优点：

17、(1)本发明采用异养发酵方法培养蛋白核小球藻，培养过程中流加20％氨水，既能调节培养液的ph值，又可以补充氮源，从而大大提高了蛋白核小球藻蛋白的积累。在制备蛋白核小球藻蛋白液的过程中，通过加入氢氧化钠和中性蛋白酶，提高了蛋白的溶出率，通过水浴给中性蛋白酶提供了适宜的温度。再用超声辅助提取蛋白核小球藻蛋白，蛋白溶出率较单纯热碱法有大幅度提高。经后续性能测定，蛋白液中蛋白溶出率高达91.51％。

18、(2)采用本发明工艺制备的蛋白核小球藻蛋白的溶解度、持水性、表面疏水性、乳化性、乳化稳定性都比不经过中性蛋白酶处理的蛋白(对照例蛋白)有了明显提高，蛋白的溶解度从对照例的29.56％提升到81.89％，乳化性从对照例的70.29m2/g提升到95.25m2/g；乳化稳定性从对照例的15.75min提升到41.25min。相比对照例的蛋白，本发明制备的蛋白粒径更小，蛋白液更均一稳定，且制备的蛋白核小球藻蛋白对dpph自由基和abts自由基的清除率都比对照例有了明显提高，因而蛋白核小球藻蛋白具有优异的抗氧化活性。

19、(3)本发明提供了一种新的获取蛋白质的方法，相较于传动的动物蛋白和植物蛋白，藻类蛋白不需要占用大量的养殖或种植场地，不需要饲养、宰杀或种植、收获等繁琐的步骤，藻类蛋白通过发酵获得藻液，过筛后烘干获得藻粉，再经过氢氧化钠和中性蛋白酶的处理，获得蛋白液，后续再制备粗蛋白和进一步获取纯化蛋白，使蛋白质的获取周期大大缩短，且占地面积小，成本低，容易实施。