纤毛疾病的治疗的制作方法

本发明涉及用于治疗患有纤毛疾病(ciliopathy)的受试者的纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物，其中所述多核糖核苷酸编码其缺陷与所述纤毛疾病相关的蛋白的功能性版本，并且其中当所述受试者表现出呼吸系统的炎症时将所述药物组合物施用于所述受试者的呼吸系统。本发明进一步涉及一种用于分析多核糖核苷酸对纤毛形成的作用的方法，其中所述多核糖核苷酸编码参与纤毛形成和/或纤毛形成所需要的蛋白。

背景技术：

1、氧气攸关许多多细胞生物体的生死，因为它对细胞的能量供应至关重要。在哺乳动物中，空气中包含的氧气可以通过呼吸系统进入生物体，呼吸系统是指参与呼吸的器官。这些器官包括例如，鼻、咽喉、喉、气管、支气管和肺。在后者中，来自环境的气体与包含在内部血液循环系统中的气体交换，从而将氧气从肺转运到生物体的不同部分中的细胞。然而，除了所需的氧气之外，其他成分也可以通过呼吸系统进入生物体，其他成分如空气中包含的刺激剂，包括污染物、致病剂和病原体，如病毒和细菌。因此，存在防御机制诸如咳嗽反射和打喷嚏，以用于将刺激剂从呼吸系统中排出。为了排出，刺激剂被包埋在由呼吸系统中的上皮细胞分泌的粘性粘液中，然后通过纤毛细胞被转运穿过(穿越，横过，across)上皮表面。

2、纤毛细胞可以通过多条运动纤毛(motile cilia)的同步搏动将粘液和刺激剂转运穿过上皮表面。纤毛是膜包裹的管状结构，其从上皮表面延伸到与环境接触的呼吸系统的空间中。在细胞内，纤毛的轴丝(axoneme)通过锚定结构被锚定在基体上。轴丝是微管的中央束(central bundle)，其中九个外部双微管围绕中央对单微管(即在呼吸纤毛中)。外部双微管和中央对微管通过放射辐连接。九个外部双微管中的每一个都由a细管和b细管组成，其中双微管通过一个连接蛋白-动力蛋白调节复合物(nexin-dynein regulatorycomplex)在圆周方向上相互连接。内动力蛋白臂和外动力蛋白臂连接至每个a细管。这些动力蛋白臂包含可以沿微管行走的运动蛋白，导致纤毛弯曲并且因此导致纤毛搏动(参见，例如，lodish等人,2000,《分子细胞生物学(molecular cell biology)》,第4版，纽约：w.h.freeman，第19.4节)。使用布氏锥虫(trypanosoma brucei)模型对纤毛结构进行的研究表明，这些结构成分中的一些表现出快速的周转，而放射辐、中央对和外动力蛋白臂的骨骼成分(skeletal components)在发育期间主要被整合在纤毛结构的远端(vincensini等人，《生物学细胞(biol cell)》,2018,110:1-15)。

3、由于纤毛细胞的同步搏动对于流体跨上皮表面的转运至关重要，因此纤毛结构的扰动(perturbations)可以导致严重的障碍。运动性缺陷(包括降低的搏动幅度和/或频率和/或不同步性)可因例如动力蛋白臂的减少或丧失、微管排列的瓦解(包括定位错误(mislocalization))和每个轴丝的微管总数的变化及其组合而发生。就目前所知，这些功能性轴丝元件的变化是由潜在的遗传缺陷引起的。这主要是由于编码轴丝成分的基因(包括上述基因)的序列的变化。由于基因可以被转录成多核糖核苷酸，诸如mrna，而多核糖核苷酸又可以被翻译成蛋白，基因的dna序列从量和功能方面影响相应蛋白的合成。由于由序列改变引起的纤毛障碍(即纤毛疾病)是遗传性的，因此与包括胚胎或新生儿在内的所有发育阶段的纤毛运动性缺陷有关，纤毛疾病可能对生物体产生严重后果。

4、纤毛障碍的熟知的示例是原发性纤毛运动障碍(pcd)，这是一种通常与肺功能下降相关的进行性障碍。因此，需要长期治疗，包括例如胸部叩击和体位引流，以用于增强粘液清除率(clearance)且会越来越频繁，在严重情况下甚至需要肺移植。此外，pcd患者患有肺部和/或耳部的反复感染，通常还患有生育力低下、脑积水和身体偏侧(即左右轴)缺陷以及视网膜问题和/或神经系统问题。但是，不论大多数纤毛疾病的严重程度如何，到目前为止还没有用于治疗纤毛疾病(如pcd)的标准化有效策略。目前的疗法是例如，从囊性纤维化中推断出来的，并且在大多数情况下，甚至没有针对待治疗的特定纤毛疾病(如例如pcd)进行过验证。因此，需要手头有一种能够有效地治疗患有纤毛疾病(如pcd)的受试者的解决方案。

5、本技术通过提供如在权利要求中所述的实施例，解决了在患有纤毛疾病(如pcd)的受试者中恢复纤毛功能的需要。

技术实现思路

1、特别地，本发明涉及一种用于治疗患有纤毛疾病的受试者中的纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物，其中所述多核糖核苷酸编码其缺陷与所述纤毛疾病相关的蛋白的功能性版本，并且其中当所述受试者表现出呼吸系统的炎症时将所述药物组合物施用于所述受试者的呼吸系统。

2、本发明基于这样的发现，即通过用编码所述蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸转染细胞(其显示纤毛的蛋白复合物的某种蛋白中的缺陷并且其缺陷导致适当的纤毛功能的丧失)来恢复适当的纤毛功能确实是可能的。然而，还发现纤毛细胞必须在分化期间的早期阶段被转染以达到这种效果。这导致了实际问题，因为携带纤毛的上皮细胞的前体细胞(即基底细胞)不能通过气道系统获取以进行转染，因为它们位于上皮的更深处并且不暴露在表面上。根据本发明，当患有纤毛疾病的受试者表现出呼吸系统的炎症时，通过施用多核糖核苷酸实现上皮细胞的转染。在呼吸系统的炎症期间，气道上皮表现出病变和创伤，这使得纤毛细胞的前体细胞(即尚未开始纤毛形成的基底细胞)可及。用表达相应蛋白的功能性版本的如上所述的多核糖核苷酸转染这些细胞允许能够使这些细胞变成形成功能性纤毛或至少部分功能性纤毛的细胞，从而导致可以显著减轻相应症状。

3、在本发明的上下文中，术语“纤毛疾病”是指与纤毛细胞的缺陷相关和/或以纤毛细胞的缺陷为特征的疾病。因此，纤毛疾病包括纤毛结构的障碍和/或纤毛功能，纤毛结构包括纤毛锚定结构、纤毛结构在细胞内锚定于其上的基体。纤毛疾病的示例包括pcd、巴-比综合征、simpson-golabi-behmel综合征(2型)、莱伯先天性黑矇(leber congenitalamaurosis)、肾消耗病(nephronophthisis)、颅骨外胚层发育不良(cranioectodermaldysplasia)(sensenbrenner)(参见例如mitchison等人,2017,《超微病理学(ultrastructural pathology)》，41(6):415-427)。

4、如本文使用的术语“纤毛疾病”是指由受试者的dna(例如染色体或线粒体dna)中的遗传缺陷引起的纤毛疾病。这种遗传缺陷可以由突变引起，并且可以包括序列部分的损失、添加或交换。示例是拷贝数变异、存在/缺失变异、缺失(完全或部分)、插入、错义突变(miss-sense mutation)、无义突变、剪接位点变异或其组合。dna中的此类变化可导致编码蛋白的可利用性发生变化，如蛋白的量的损失或减少，或者导致具有改变的功能的蛋白。

5、在一个优选的实施例中，术语“纤毛疾病”是指与运动纤毛的缺陷有关的疾病。这种纤毛疾病的一个示例是原发性纤毛运动障碍(pcd)。pcd是一种由运动纤毛的功能障碍引起的罕见的疾病。pcd在遗传、功能和超微结构水平上具有异质性。pcd与受损的粘液转运和清除率有关。患有pcd的受试者表现出复发性鼻塞、鼻窦感染、耳部感染、不孕、诸如完全性内脏逆位和内脏异位的位置异常(situs abnormalities)(也被称为“不定位(situsambiguous)”)和/或脑积水。在分子水平上，pcd在大多数情况下与呼吸系统的纤毛的结构、功能和生物发生的异常有关。这类异常的示例为缺失或缩短的动力蛋白臂、缺陷性中央对复合物、放射辐或连接蛋白链。此类异常以及因此与pcd相关的纤毛运动性缺陷是由编码相应成分的基因中的突变引起的，特别是由表1中所列的基因中的突变引起的，其中“a”组和“b”组是指具有致病突变的基因，其各自估计占pcd病例的至少1％和小于1％(参见zariwala等人,2007,2015更新，“原发性纤毛运动障碍(primary ciliarydyskinesia)”，编辑adam等人,西雅图(wa):西雅图华盛顿大学(university ofwashington,seattle)；1993-2018)。

6、因此，包含在根据本发明的药物组合物中的多核糖核苷酸优选地是可以被翻译成表1中所列的蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸。

7、更优选地，包含根据本发明的药物组合物中的多核糖核苷酸是可以被翻译成蛋白的功能性版本的mrna，蛋白选自由以下组成的群组：dnah5、dnah11、ccdc39、dnai1、ccdc40、ccdc103、spag1、zmynd10、armc4、ccdc151、dnai2、rsph1、ccdc114、rsph4a、dnaaf1(lrrc50)、dnaaf2(ktu)和lrrc6。

8、表1

9、

10、

11、在本公开的任何前述或其他方面和实施例的一些实施例中，所述多核糖核苷酸或修饰的多核糖核苷酸包含与seq id no:1或5至11中的一种或多种(例如，与seq id no:1或5至11所示的序列)至少85％、至少90％、至少92％或至少95％相同(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)的一级序列。在一些实施例中，所述多核糖核苷酸是修饰的多核糖核苷酸，其具有选自本文所述的任何此类水平和/或类型的修饰水平和/或类型。在某些实施例中，多核糖核苷酸的同一性百分比仅相对于seq id no:1或5至11的ccdc40编码序列-部分来测量(例如，在计算同一性百分比时不考虑utr、其他非编码序列和gfp或表位标签)。在前述任一项的某些实施例中，这种多核糖核苷酸(或修饰的多核糖核苷酸)编码功能性ccdc40蛋白。

12、在本公开的任何前述或其他方面和实施例的一些实施例中，多核糖核苷酸或修饰的多核糖核苷酸包含与seq id no:2或12至14中的一种或多种(例如，与seq id no:2或12至14所示的序列)至少85％、至少90％、至少92％或至少95％相同(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)的一级序列。在一些实施例中，所述多核糖核苷酸是修饰的多核糖核苷酸，其具有选自本文所述的任何此类水平和/或类型的修饰水平和/或类型。在某些实施例中，多核糖核苷酸的同一性百分比仅相对于seq id no:2或12至14的ccdc39编码序列-部分来测量(例如，在计算同一性百分比时不考虑utr、其他非编码序列和gfp标签或表位标签)。在前述任一项的某些实施例中，这种多核糖核苷酸(或修饰的多核糖核苷酸)编码功能性ccdc39蛋白。

13、在本公开的任何前述或其他方面和实施例的一些实施例中，多核糖核苷酸或修饰的多核糖核苷酸包含与seq id no:4(例如，与seq id no:4所示的序列)至少85％、至少90％、至少92％或至少95％相同(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)的一级序列。在一些实施例中，所述多核糖核苷酸是修饰的多核糖核苷酸，其具有选自本文所述的任何此类水平和/或类型的修饰水平和/或类型。在某些实施例中，多核糖核苷酸的同一性百分比仅相对于seq id no:4的mcidas编码序列-部分来测量(例如，在计算同一性百分比时，不考虑utr、其他非编码序列和gfp或表位标签)。在前述任一项的某些实施例中，这种多核糖核苷酸(或修饰的多核糖核苷酸)编码功能性mcidas蛋白。

14、在某些实施例中，本公开提供了包含前述任一项多核糖核苷酸的药物组合物。此外，任何此类多核糖核苷酸(或药物组合物)可以用于本文所述的任何方法中。

15、在用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物的一个实施例中，所述纤毛疾病与包含卷曲螺旋结构域的40(ccd 40；分别参见例如，人mrna的ncbi参考序列nm_017950.4和np_060420.2以及蛋白ccdc40序列)蛋白中的缺陷有关或者与包含卷曲螺旋结构域的39(ccdc39，分别参见例如，人mrna的ncbi参考序列nm_181426.2和np_852091.1和蛋白ccdc39序列)蛋白中的缺陷有关。

16、ccdc40和ccdc39构建了位于放射辐和a-细管之间的复合物。ccdc40或ccdc39蛋白的缺陷版本可能由ccdc40基因中或ccdc39基因中的突变(如插入、缺失、无义和剪接位点突变)引起。特别地，编码ccdc40蛋白的dna序列中248位的缺失和2824位与2825位之间的tgt插入似乎非常频繁。ccdc40或ccdc39的缺陷版本会导致轴丝结构的缺陷，如缺失或偏心中央对、异常放射辐和连接蛋白链、动态蛋白调节复合物的异常组装和/或内部动态蛋白臂的减少。因此，包含在根据本发明的药物组合物中的多核糖核苷酸优选地是可以被翻译成ccdc40和/或ccdc39的功能性版本的mrna。关于参与纤毛形成的蛋白以及与纤毛疾病相关的基因和分子途径的更多信息可以在例如reiter和leroux的综述文章(reiter和leroux，2017,《自然评论分子细胞生物学(nat rev mol cell biol)》，18(9):533-547)中找到。

17、本发明的药物组合物将被施用于患有纤毛疾病的受试者。在本文中，患有纤毛疾病的受试者也可以被称为患者。患者可能表现出异常的纤毛结构和/或功能和/或生物发生缺陷，导致粘液和细菌滞留在呼吸道中。对给定受试者的纤毛疾病的诊断可以基于例如对所述受试者的活检的临床发现、分子分析和/或纤毛超微结构分析，如例如还在goutaki等人(goutaki等人,2016,《欧洲呼吸杂志(eur respir j)》,48(4):1081-1095)中所综述。

18、在本发明的上下文中，术语“多核糖核苷酸”是指由腺苷、鸟苷、胞苷和/或尿苷残基(以修饰的形式或未修饰的形式，参见下文)组成的单链序列。在本文中，术语“编码蛋白的多核糖核苷酸”是指包含编码蛋白的编码区，即可以被翻译成氨基酸序列的多核糖核苷酸。因此，在本发明的上下文中，术语“编码蛋白的多核糖核苷酸”优选地是指mrna，其中mrna应被理解为意指任何多核糖核苷酸分子，如果其进入细胞，则适合于蛋白的表达或可以翻译成蛋白。

19、在本文中，术语“蛋白”涵盖任何种类的氨基酸序列，即两个或更多个氨基酸的链，各氨基酸通过肽键连接。在本上下文中使用的术语“蛋白”是指任何感兴趣的氨基酸序列。优选地，编码的氨基酸序列为至少5个氨基酸长，更优选地至少10个氨基酸，甚至更优选地至少50、100、200或500个氨基酸。因此，术语“蛋白”包括短肽以及多肽。关于编码的蛋白的功能，除了所述蛋白的缺陷变体与纤毛疾病有关之外，没有其他限制。在本文中，术语“与……有关”旨在包括术语“引起……”、“参与……”和/或“增强……”。

20、在本文中，术语“其缺陷……的蛋白”是指“缺陷蛋白”或“蛋白的缺陷版本”，并且因此，是指与所述蛋白的功能性版本相比具有改变的功能的蛋白的版本。然而，所述术语也可以涵盖完全或部分缺乏合成并且从而在细胞中完全或部分缺乏可利用性的所述蛋白的版本。在任何情况下，蛋白版本的缺陷导致所述蛋白的版本不能实现蛋白的天然功能。

21、实现其天然功能的蛋白的版本在本文中被称为“功能性蛋白”或“蛋白的功能性版本”，并且由与相应缺陷蛋白相同的dna序列编码，但是没有引起dna序列改变的缺陷，并且因此，在dna序列中没有突变。

22、因此，在本发明的上下文中，“功能性蛋白”优选地是a-细管、b-细管、或连接蛋白-动力蛋白调节复合物、或放射辐、内动力蛋白臂、和/或外动力蛋白臂的构建块。

23、因此，术语“多核糖核苷酸编码其缺陷与所述纤毛疾病相关的蛋白的功能性版本”优选地是指编码功能性蛋白的mrna，所述功能性蛋白参与纤毛轴丝、轴丝锚定结构或基体的结构组织并实现其天然功能。因此，根据本发明的多核糖核苷酸优选地是指编码功能性蛋白的mrna，其在患有纤毛疾病的受试者的细胞中的存在对于缓解或预防与如由细胞的dna序列编码的所述蛋白的缺陷相关的纤毛疾病的表现或减轻相关症状是需要的或有益的。

24、此外，根据本发明使用的多核糖核苷酸还可以包含进一步的功能区和/或3'或5'非编码区。3'和/或5'非编码区可以是天然地侧接于编码的蛋白的序列，或有助于所述多核糖核苷酸的稳定和/或调节的人工序列。可以通过常规实验来鉴定和研究合适的序列。进一步地，所述多核糖核苷酸还可以具有进一步的功能区，并且可以与微小rna的调节元件和靶序列结合，例如用于在空间和时间上控制所需多核糖核苷酸的活性，所需多核糖核苷酸包括编码蛋白的序列，即例如关于特定细胞或细胞类型和/或发育阶段或特定时间范围。

25、根据本发明使用的多核糖核苷酸可以包含部分或完全密码子优化的序列，其来源于待使用的天然序列。密码子优化是指一种通过提高相应多核糖核苷酸的翻译效率来最大化蛋白表达的技术，因为在一些情况下存在会优先被某些物种用于给定的氨基酸的密码子。进一步地，所述多核糖核苷酸可以包括进一步的修饰以调节和/或延长作用持续时间。所述多核糖核苷酸还可能含有m7gpppg帽、内部核糖体进入位点(ires)和/或3'端的polya尾和/或用于促进翻译的附加序列。

26、在本发明的一些实施例中，根据本发明使用的多核糖核苷酸可以包含未修饰的核苷酸和修饰的核苷酸。本文使用的术语“未修饰的核苷酸”是指a、c、g和u核苷酸。本文使用的术语“修饰的核苷酸”是指a、c、g和u核苷酸的任何天然存在的或非天然存在的异构体，以及具有例如化学修饰或取代的残基的任何天然存在的或非天然存在的类似物、替代或修饰的核苷酸或其异构体。修饰的核苷酸可以具有碱基修饰和/或糖修饰。修饰的核苷酸也可以具有磷酸基团修饰，例如，关于mrna分子的五个prime帽。修饰的核苷酸还包括通过核苷酸的共价修饰在转录后合成的核苷酸。进一步地，非修饰的核苷酸和修饰的核苷酸的任何合适的混合物都是可能的。修饰的核苷酸的许多非限制性示例可以在文献中找到(例如，cantara等人，《核酸研究(nucleic acids res)》,2011,39(增补刊_1):d195-d201；helm和alfonzo,《化学生物学(chem biol)》，2014,21(2):174-185；carell等人,《应用化学国际版(angew chem int ed engl)》,2012,51(29):7110-31)并且一些优选的修饰核苷酸基于其各自的核苷残基在下文中示例性提及：1-甲基腺苷、2-甲硫基-n6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰腺苷、2-甲基腺苷、2'-o-核糖基磷酸腺苷、n6-甲基-n6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、n6-乙酰基腺苷、n6-甘氨酰基氨基甲酰基腺苷、n6-异戊烯基腺苷、n6-甲基腺苷、n6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、n6,n6-二甲基腺苷、n6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、n6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷、1,2'-o-二甲基腺苷、n6,2'-o-二甲基腺苷、2'-o-甲基腺苷、n6,n6,2'-o-三甲基腺苷、2-甲硫基-n6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-n6-甲基腺苷、2-甲硫基-n6-异戊烯基腺苷、2-甲硫基-n6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、n6-2-甲硫基-n6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、2-甲硫基-n6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、7-甲基腺苷、2-甲硫基-腺苷、2-甲氧基-腺苷、2'-氨基-2'-脱氧腺苷、2'-叠氮基-2'-脱氧腺苷、2'-氟-2'-脱氧腺苷、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺苷、7-脱氮-8-氮杂-腺苷、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤；2-硫胞苷、3-甲基胞苷、n4-乙酰胞苷、5-甲酰胞苷、n4-甲基胞苷、5-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-羟基胞苷、赖胞苷、n4-乙酰基-2'-o-甲基胞苷、5-甲酰基-2'-o-甲基胞苷、5,2'-o-二甲基胞苷、2-o-甲基胞苷、n4,2'-o-二甲基胞苷、n4,n4,2'-o-三甲基胞苷、异胞苷、假胞苷、假异胞苷、2-硫胞苷、2'-甲基-2'-脱氧胞苷、2'-氨基-2'-脱氧胞苷、2'-氟-2'-脱氧胞苷、5-碘胞苷、5-溴胞苷、2'-叠氮基-2'-脱氧胞苷、2'-氨基-2'-脱氧胞苷、2'-氟-2'-脱氧胞苷、5-氮杂-胞苷、3-甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并胞苷、吡咯并假异胞苷、2-硫代-5-甲基胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-l-甲基-假异胞苷、4-硫代-l-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-l-脱氮-假异胞苷、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-l-甲基-假异胞苷、泽布拉林(zebularine)、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林；1-甲基鸟苷、n2,7-二甲基鸟苷、n2-甲基鸟苷、2'-o-核糖磷酸鸟苷、7-甲基鸟苷、羟基怀丁苷、7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷、7-氰基-7-脱氮鸟苷、n2,n2-二甲基鸟苷、n2,7,2'-o-三甲基鸟苷、n2,2'-o-二甲基鸟苷、1,2'-o-二甲基鸟苷、2'-o-甲基鸟苷、n2,n2,2'-o-三甲基鸟苷、n2,n2j-三甲基鸟苷、异鸟苷、4-去甲基怀俄苷、环氧辫苷、未充分修饰的羟基怀丁苷、甲基化的未充分修饰的羟基怀丁苷、异怀俄苷、过氧怀丁苷、半乳糖基-辫苷、甘露糖基-辫苷、辫苷、古嘌苷、怀丁苷、甲基怀俄苷、怀俄苷、7-氨基羧丙基去甲基怀俄苷、7-氨基羧丙基怀俄苷、7-氨基羧丙基怀俄苷甲基酯、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、n2-甲基-6-硫代-鸟苷、n2,n2-二甲基-6-硫代-鸟苷、n1-甲基鸟苷、2'-氨基-3'-脱氧鸟苷、2'-叠氮基-2'-脱氧鸟苷、2'-氟-2'-脱氧鸟苷、2-硫尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷、3-甲基尿苷、4-硫尿苷、5-甲基-2-硫尿苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-羧甲基尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿苷、5-羟基尿苷、5-甲基尿苷、5-牛磺酰基甲基尿苷(5-taurinomethyluridine)、5-氨基甲酰基甲基尿苷、5-(羧羟甲基)尿苷甲酯、二氢尿苷、5-甲基二氢尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-(羧羟甲基)尿苷、5-(羧羟甲基)-2'-o-甲基尿苷甲酯、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫尿苷、3,2'-o-二甲基尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2'-o-甲基尿苷、5-氨基甲酰基羟基甲基尿苷、5-氨基甲酰基甲基-2'-o-甲基尿苷、5-氨基甲酰基甲基-2-硫尿苷、5-甲氧羰基甲基-2'-o-甲基尿苷、5-(异戊烯基氨基甲基)-2'-o-甲基尿苷、5,2'-o-二甲基尿苷、2'-o-甲基尿苷、2'-o-甲基-2-硫尿苷、2-硫代-2'-o-甲基尿苷、尿苷5-氧乙酸、5-甲氧羰基甲基尿苷、尿苷5-氧乙酸甲酯、5-甲氧基尿苷、5-氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硒尿苷、5-甲氧羰基甲基-2-硫尿苷、5-牛磺酰基甲基-2-硫尿苷、假尿苷、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷、1-甲基假尿苷、3-甲基假尿苷、2'-o-甲基假尿苷、5-甲酰尿苷、5-氨基甲基-2-香叶基尿苷、5-牛磺酰基甲基尿苷、5-碘尿苷、5-溴尿苷、2'-甲基-2'-脱氧尿苷、2'-氨基-2'-脱氧尿苷、2'-叠氮基-2'-脱氧尿苷、2'-氟-2'-脱氧尿苷、肌苷、1-甲基肌苷、1,2'-o-二甲基肌苷、2'-o-甲基肌苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、1-牛磺酰基甲基-假尿苷、5-牛磺酰基甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酰基甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-l-甲基-假尿苷、2-硫代-l-甲基-假尿苷、1-甲基-l-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-l-脱氮-假尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、1,2'-o-二甲基腺苷、1,2'-o-二甲基鸟苷、1,2'-o-二甲基肌苷、2,8-二甲基腺苷、2-甲硫基亚甲基硫代-n6-异戊烯基-腺苷、2-香叶基硫尿苷、2-赖胞苷、2-甲硫基环状n6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、2-甲硫基-n6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-n6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基腺苷、2-甲硫基-n6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、2-硒尿苷、2-硫代-2'-o-甲基尿苷、2'-o-甲基腺苷、2'-o-甲基胞苷、2'-o-甲基鸟苷、2'-o-甲基肌苷、2'-o-甲基假尿苷、2'-o-甲基尿苷、2'-o-甲基尿苷5-氧乙酸甲酯、2'-o-核糖基腺苷磷酸酯、2'-o-核糖基鸟苷磷酸、3,2'-o-二甲基尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)-5,6-二氢尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷、5,2'-o-二甲基胞苷、5,2'-o-二甲基尿苷、5-(羧基羟甲基)-2'-o-甲基尿苷甲酯、55-(异戊烯基氨基甲基)-2'-o-甲基尿苷、5-氨基甲基-2-香叶基硫尿苷、5-氨基甲基-2-硒尿苷、5-氨基甲基尿苷、5-氨基甲酰基甲基-2'-o-甲基尿苷、5-羧基羟甲基尿苷、5-羧甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2-香叶基硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2-硒尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2'-o-甲基尿苷、5-氰基甲基尿苷、5-甲酰基-2'-o-甲基胞苷、5-甲氧羰基甲基-2'-o-甲基尿苷、5-甲基氨基甲基-2-香叶基硫尿苷、7-氨基羧丙基-去甲基怀俄苷、7-甲基鸟苷、8-甲基腺苷、n2,2'-o-二甲基鸟苷、n2,7,2'-o-三甲基鸟苷、n2,7-二甲基鸟苷、n2,n2,2'-o-三甲基鸟苷、n2,n2,7-三甲基鸟苷、n2,n2,7-三甲基鸟苷、n4,2'-o-二甲基胞苷、n4,n4,2'-o-三甲基胞苷、n4,n4-二甲基胞苷、n4-乙酰基-2'-o-甲基胞苷、n6,2'-o-二甲基腺苷、n6,n6,2'-o-三甲基腺苷、n6-甲酰腺苷、n6-羟甲基腺苷、agmatidine、2-甲硫基环状n6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷、谷氨酰基-辫苷、加到任何核苷酸上的鸟苷、鸟苷酸化的5'末端、羟基-n6-苏氨酰基氨基甲酰基腺苷；最优选地假尿苷、n1-甲基-假尿苷、2'-氟-2'-脱氧胞苷、5-碘胞苷、5-甲基胞苷、2-硫尿苷、5-碘尿苷和/或5-甲基-尿苷。

27、此外，术语“修饰的核苷酸”包括含有诸如氘的同位素的核苷酸。术语“同位素”是指具有相同数量的质子但不同数量的中子导致不同质量数的元素。因此，例如，氢的同位素不限于氘，还包括氚。此外，多核糖核苷酸还可以含有其他元素的同位素，其他元素包括例如碳、氧、氮和磷。还可能的是，修饰的核苷酸是氘化的，或者包含氢的或氧、碳、氮或磷的另一种同位素。

28、多核糖核苷酸中修饰的核苷酸类型的总数可以是0、1、2、3或4。因此，在一些实施例中，一种核苷酸类型的至少一个核苷酸(例如至少一个u核苷酸)可以是修饰的核苷酸。在一些实施例中，总共两种核苷酸类型中的至少一个核苷酸(例如至少一个u核苷酸和至少一个c核苷酸)可以是修饰的核苷酸。在一些实施例中，总共三种核苷酸类型中的至少一个核苷酸(例如至少一个g核苷酸、至少一个u核苷酸和至少一个c核苷酸)可以是修饰的核苷酸。在一些实施例中，所有四种核苷酸类型中的至少一个核苷酸可以是修饰的核苷酸。在所有这些实施例中，可以修饰每种核苷酸类型的一个或多个核苷酸，每种核苷酸类型的所述修饰的核苷酸的百分比为0％、2.5％、5％、7.5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或100％。

29、在一些实施例中，待纯化的mrna分子中包含的修饰的核苷酸的总百分比为0％、2.5％、5％、7.5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或100％。

30、因此，多核糖核苷酸的特征可以在于例如0.5-50％，优选地5-50％的u核苷酸和5-50％的c核苷酸被修饰。所述修饰的u核苷酸优选地为5-碘尿苷，并且所述修饰的c核苷酸优选地为5-碘胞苷。

31、在一些实施例中，多核糖核苷酸的特征可以在于15-25％的u核苷酸和3-15％，优选地5-15％的c核苷酸被修饰，其中所述修饰的u核苷酸优选地为5-甲基尿苷，并且所述修饰的c核苷酸优选地为5-碘胞苷。

32、在一些实施例中，多核糖核苷酸的特征可以在于30-50％的u核苷酸和10-20％的c核苷酸被修饰，其中所述修饰的u核苷酸优选地为5-碘尿苷，并且所述修饰的c核苷酸优选地为5-碘胞苷。

33、在一些实施例中，多核糖核苷酸的特征可以在于30-50％的u核苷酸和5-15％的c核苷酸被修饰，其中所述修饰的u核苷酸优选地为5-碘尿苷，并且所述修饰的c核苷酸优选地为5-碘胞苷。

34、在一些实施例中，多核糖核苷酸的特征可以在于0.5-5％的u核苷酸和25-35％的c核苷酸被修饰，其中所述修饰的u核苷酸优选地为2-硫尿苷，并且所述修饰的c核苷酸优选地为5-甲基胞苷。

35、多核糖核苷酸的特征还可以在于例如50-100％，优选地100％的u核苷酸被修饰。所述修饰的u核苷酸优选地为n1-甲基-假尿苷。

36、如上所述，根据本发明，当受试者表现出呼吸系统的炎症时，将药物组合物施用于患有纤毛疾病的患者。在本发明的上下文中，术语“炎症”是指对包括感染、创伤和超敏反应在内的损伤(insults)的细胞应答。“呼吸系统的炎症”是指呼吸系统中的炎症反应，尤其是但不限于鼻、咽、喉、气管、支气管和/或肺中的炎症反应。例如，呼吸系统中的炎症反应可能由诸如病原体、毒素、污染物和/或过敏原的刺激剂引起。在炎症期间，特定的细胞类型被激活，其可以释放例如细胞因子和介质以改变其他细胞的活性。这些过程在例如iwasaki等人(iwasaki等人,2017,《自然评论免疫学(nat rev immunol)》,17(1):7-20)中描述。

37、因此，在一个实施例中，待施用多核糖核苷酸的患有纤毛疾病的受试者在治疗前已经进行过测定，以确定受试者是否患有呼吸系统的炎症，并且其中受试者已经被肯定地确定患有呼吸系统的炎症。

38、优选地，呼吸系统的炎症是急性炎症。急性炎症可能在数秒、数分钟、数小时和数天内发生，但可能不会在更长时间内发生。因此，急性炎症是在长达4周的时间范围内，优选地在小于3周的时间范围内发生的炎症。可以通过常规实验室方法根据局部增加的血流量、局部增加的毛细血管的通透性和/或中性粒细胞、巨噬细胞和/或淋巴细胞增加的数量来确定。有关原发性纤毛运动障碍中气道炎症的标志物的更多信息可以在例如zihlif等人(zihlif等人,2006,《小儿过敏(pediatr pulmonol)》,41(6):509-14)中找到。

39、通常，炎症可以被分为急性或慢性。急性炎症是身体对有害刺激的反应，并且特征在于例如粒细胞向受影响的组织的移动增加。炎症的典型体征是发热、疼痛、发红、肿胀和功能丧失。纤毛疾病(如，pcd)是一种遗传性障碍，并且因此(如果未得到治疗)是一种由功能丧失引起的永久性终身刺激，导致永久性以及因此慢性种类的炎症，通常不表现出上述症状(除了功能的丧失之外)。与慢性炎症相关的疾病的进一步的示例为例如：花粉热、牙周病、动脉粥样硬化和骨关节炎。尽管如此，患有此类疾病的患者还可能例如通过受到附加的有害刺激而患上急性炎症，并且因此导致一种或多种经典症状(如炎症的经典体征)发热、疼痛、发红、肿胀和附加的功能丧失。

40、因此，在一个实施例中，待施用多核糖核苷酸的患有纤毛疾病的受试者在治疗前已经进行过测定，以确定受试者是否患有呼吸系统的急性炎症，并且其中受试者已经被肯定地确定患有呼吸系统的急性炎症。

41、可替代地或另外地，呼吸系统的炎症是指炎症的加重(exacerbation)，优选地炎症的急性加重。加重指疾病的恶化或其症状的增加。最好在慢性阻塞性肺病(copd)的背景下进行研究，因为加重会导致患者生活质量的下降，加速肺功能的下降，并显著增加疾病相关费用。

42、在临床试验的情况下，呼吸系统加重可以被定义如下：“呼吸系统加重在试验中被定义为导致开始全身性抗生素治疗的呼吸道症状(不考虑细菌培养的结果)，或者被定义为预测的一秒钟用力呼气量下降(fev1)％相对于筛选和随机化时预测的fev1％的平均值等于或高于10个百分点，无论是否开出抗生素。加重的发生可以通过患者访谈、体格检查和肺活量测定来评估。在每次试验访视时以及在因恶化而与试验点进行任何附加接触时，可以关于自上次与试验点接触以来的症状和合用药物与参与者进行访谈。可以通过每周关于症状和抗生素的患者日记对访谈进行补充。在所有访视时，均可以进行体格检查，检查参与者的一般状况、生命体征、耳朵、心脏和肺。”(参考例如kobbernagel等人,2016,《bmc肺部医学(bmc pulmonary medicine)》,16:104)。

43、因此，根据一个优选的实施例，药物组合物包含用于治疗患有纤毛疾病的受试者的纤毛疾病的mrna，其中mrna编码其缺陷与所述纤毛疾病相关的纤毛结构蛋白的功能性版本，并且其中当患有纤毛疾病的受试者表现出呼吸系统的急性炎症，优选地急性加重时，将所述药物组合物施用于患有所述纤毛疾病的所述受试者的呼吸系统。

44、因此，在一个实施例中，待施用多核糖核苷酸的患有纤毛疾病的受试者在治疗前已经进行了测定，以确定受试者是否患有呼吸系统的急性炎症，优选地急性加重，并且其中受试者已经被肯定地确定患有呼吸系统的慢性炎症，优选地急性加重。

45、患有纤毛疾病的受试者的呼吸系统的炎症的存在或不存在可以通过常规程序来确定，例如，通过分析血液样品或通过确定患者是否患有鼻漏等。

46、在呼吸系统中，炎症通常由感染(特别是病毒或细菌感染)引起。因此，纤毛疾病患者中炎症的存在或不存在可以优选地通过确定感染(优选地急性感染)的存在或不存在来评估。优选地，感染是病毒和/或细菌感染。

47、急性感染的特征在于听诊发现、脓性咳嗽、浸润、咳血、发热、血液炎症参数升高(c反应性蛋白(crp)>200mg/ml，血沉<100mm/h)。慢性感染的进一步特征在于移行性浸润、抗生素耐药性、持续性一般症状和中度升高的血液炎症标志物(crp 50-100mg/ml，血沉<50mm/h)(klinische pneumonologie,1.aufl.2014georg thieme verlag kg,isbn 978-3-13-129751-8；jaroszewski等人,2012,《临床胸腔外科(thorac surg clin)》,22(3):301-24)。

48、在本发明的上下文中，术语“呼吸系统”包括参与呼吸的器官，如鼻、咽、喉、气管、支气管和肺。特别地，在本文中也被称为受试者的一些哺乳动物(包括人)的情况下，呼吸系统也可以被称为呼吸道。在本文中，术语“呼吸系统”和“呼吸道”可互换使用。呼吸道可以被分为上呼吸道和下呼吸道。上呼吸道包括有包含鼻腔、鼻甲、鼻前庭和鼻道的鼻子；副鼻窦；咽部和喉在声襞(声带)上方的部分。下呼吸道包括声襞以下的喉的部分、气管、支气管和细支气管。在本文中，肺被包括在下呼吸道中，并且包括呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊和肺泡。

49、在本发明的上下文中，术语“药物组合物”是指包含至少一种根据本发明的多核糖核苷酸的组合物，用于向受试者施用以治疗纤毛疾病。多核糖核苷酸优选地以有效的量(即足以在待施用所述药物组合物的受试者中诱导可检测的治疗应答的量)被包括。本发明的药物组合物可以是无菌水溶液或非水溶液、悬浮液或乳液或气雾剂的形式。优选地，所述药物组合物为允许例如经由吸入、雾化、经由喷雾或液滴(例如鼻喷雾或鼻液滴)向呼吸系统施用的形式。

50、这对于患者是有利的，因为患者可以容易地使用喷雾、液滴、雾化器或通过吸入进行施用，便于转运，并且因此患者容易获得，而不限制任何行动自由。

51、在一个优选的实施例中，药物组合物包含mrna，mrna可以被翻译成蛋白的功能性版本，蛋白的功能性版本选自由以下组成的群组：dnah5、dnah11、ccdc39、dnai1、ccdc40、ccdc103、spag1、zmynd10、armc4、ccdc151、dnai2、rsph1、ccdc114、rsph4a、dnaaf1(lrrc50)、dnaaf2(ktu)和lrrc6，并且通过使用喷雾、液滴、雾化器和/或通过吸入施用于患有由所述蛋白的缺陷引起的pcd的受试者。更优选地，所述蛋白是ccdc40和/或ccdc39。

52、所述药物组合物可以包含药学上可接受的载体，即化合物、材料、成分和/或组合物，其在合理的医学判断的范围内，适合用于与人和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比相称。因此，药学上可接受的载体是一种非活性物质，其与药学活性物质一起配制，以便于根据剂量、吸附、溶解度或药代动力学考虑对其进行处理。合适的药物可接受载体的示例是本领域熟知的，并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、缓冲液、水、乳液(如油/水乳液)、各种类型的润湿剂和无菌溶液。特别地，水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。非水溶剂的示例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和有机酯(如油酸乙酯)。药学上可接受的载体的进一步的示例包括但不限于盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液、柠檬酸盐、磷酸盐和其他有机酸；成盐反离子，例如钠和钾；低分子量(>10个氨基酸残基)多肽；蛋白，例如血清白蛋白或明胶；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如组氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、天冬酰胺、精氨酸或甘氨酸；碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；单糖；二糖；其他糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；螯合剂，例如edta；非离子表面活性剂，例如市场上可买到的商品名为吐温的聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯、丙二醇、普朗尼克(pluronics)或聚乙二醇；抗氧化剂，包括甲硫氨酸、抗坏血酸和生育酚；和/或防腐剂，例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)。合适的药学上可接受的载体及其制剂在《雷明顿药学科学(remington's pharmaceuticalsciences)》，第17版,1985,麦克出版公司(mack publishing co.)中更详细地描述。此外，还可以存在防腐剂、稳定剂和其他添加剂，如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体、纳米体系或脂质体等。

53、本发明的药物组合物可以通过本领域技术人员已知的适合于施用于呼吸系统的很多种施用形式施用于患者，如使用喷雾剂、液滴、吸入剂、雾化器等。剂量和作用的持续时间取决于所述多核糖核苷酸要实现的功能，并且在每种情况下都必须有意识地进行调整。例如，如果所述多核糖核苷酸用于(如本文的情况)基因缺陷(即改变的dna序列)所引起的疾病的慢性疗法，则作用的持续时间将尽可能长。持续时间也可以被调整到特定的时间窗口。

54、在一个实施例中，药物组合物每周施用至少一次。这有利于确保所述pcd治疗的有效性和持久效果。优选地，药物组合物以每周为基础施用持续至少2周，更优选地持续至少3周，并且甚至更优选地持续至少4周。可替代地，所述药物组合物可以每周两次施用持续至少1周，优选地持续至少2周，更优选地持续至少3周，并且甚至更优选地持续至少4周。在一个实施例中，如果在如上所述的初始治疗持续四周后需要进一步的治疗，则以每周为基础进行治疗。作为每周施用的替代，可以将施用改为每月施用一次，持续更长的时间段，例如持续至少两个月，优选地持续至少3个月，更优选地持续至少4个月，甚至更优选地持续至少5个月，并且最优选地持续至少6个月。

55、在一个优选的实施例中，在受试者吸入适当的溶液(优选地粘液溶解剂，如高渗盐水或n-乙酰半胱氨酸(nac)的溶液)，或用适当的溶液(优选地粘液溶解剂，如高渗盐水或n-乙酰半胱氨酸(nac))冲洗他们的鼻腔和/或鼻窦，以除去粘液和潜在脱落的气道上皮细胞后，将药物组合物施用于受试者的呼吸系统。因此，优选的是，在受试者吸入适当的溶液(优选地粘液溶解剂，如高渗盐水或n-乙酰半胱氨酸(nac)的溶液)和咳出位于上皮细胞上的粘液之后，将药物组合物施用至受试者的呼吸系统。这对于在施用药物组合物之前暴露上皮细胞并且因此对于增强多核糖核苷酸的转染效率是特别有利的。

56、因此，在一个实施例中，待施用多核糖核苷酸的患有纤毛疾病的受试者是这样的受试者，其在治疗之前已经通过吸入适当的溶液(优选地粘液溶解剂，如高渗盐水或n-乙酰半胱氨酸(nac)的溶液)，或通过用适当的溶液(优选地粘液溶解剂，如高渗盐水或n-乙酰半胱氨酸(nac))冲洗他们的鼻腔和/或鼻窦。

57、这种步骤的目的是在施用多核糖核苷酸之前从受试者的呼吸系统中物理地去除粘液。

58、此外，这样的受试者优选地是在治疗之前已经进行了测定以确定受试者是否患有呼吸系统的炎症，优选地急性炎症或炎症的加重的受试者，并且其中受试者已经被肯定地确定患有呼吸系统的炎症，优选地急性炎症或炎症的加重。

59、在优选的实施例中，所述溶液中nac的浓度为3％至20％，优选地5％至15％，更优选地8％至12％，最优选地浓度为10％。百分比基于wt/wt。优选地，含有nac的溶液还含有药学上可接受浓度的依地酸钠(其中依地酸盐是指乙二胺(ethylendiamin)四乙酸盐)和/或氢氧化钠。优选地，溶液是水溶液。

60、在用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物的一些实施例中，所述药物组合物进一步包含粘液溶解剂，如n-乙酰半胱氨酸(nac)和/或包含氯化钠的高渗溶液。充当祛痰剂的nac和包含氯化钠的高渗溶液均有利于减少患有pcd的受试者中粘性粘液的滞留。这可以减小呼吸系统感染的风险，并且因此减小患者的附加应激。

61、在优选的实施例中，药物组合物进一步包含如上所述浓度的nac。

62、在优选的实施例中，药物组合物进一步包含高渗溶液，该高渗溶液包含浓度在2％与8％之间、优选地在3％与7％之间、更优选地在4％与7％之间的氯化钠。

63、在优选的实施例中，所述药物组合物进一步包含浓度在3％与20％之间、优选地在5％与15％之间、更优选在8％与12％之间、最优选地为10％的nac，和/或包含浓度在2％与8％之间、优选地在3％与7％之间、更优选地在4％与7％之间的氯化钠的高渗溶液。

64、如上所述，在根据本发明的药物组合物的一个优选实施例中，所述药物组合物包含可以被翻译成蛋白的功能性版本的mrna，该蛋白选自由以下组成的群组：dnah5、dnah11、ccdc39、dnai1、ccdc40、ccdc103、spag1、zmynd10、armc4、ccdc151、dnai2、rsph1、ccdc114、rsph4a、dnaaf1(lrrc50)、dnaaf2(ktu)和lrrc6，优选地ccdc40和/或ccdc39。在下文中，这种药物组合物也被称为“第一药物组合物”。

65、多纤毛分化和dna合成相关细胞周期(mcidas)蛋白是一种转录调节蛋白，其是多纤毛细胞分化(其包括多运动纤毛的纤毛形成)所特异性需要的(分别参考例如，人mrna的ncbi参考序列nm_001190787.1和np_001177716.1和蛋白mcidas序列；或如seq id no:4所示的优化的多核糖核苷酸序列)。

66、因此，在用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物的一些实施例中，所述药物组合物进一步包含编码多纤毛分化和dna合成相关细胞周期(mcidas)蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸。

67、在一些实施例中，所述药物组合物是如上所述的第一药物组合物，其与包含编码mcidas蛋白的多核糖核苷酸的第二药物组合物一起施用。

68、两种药物组合物，即如上定义的进一步包含编码mcidas蛋白的多核糖核苷酸的第一种药物组合物或与包含编码mcidas蛋白的多核糖核苷酸的第二药物组合物一起施用的第一药物组合物，都是有利的，因为当在纤毛形成之前和/或在纤毛形成期间将药物组合物施用于细胞时，施用根据本发明的药物组合物在恢复纤毛细胞结构和功能方面特别有效。进一步地，优选地通过使用鼻喷雾剂和/或雾化器和/或通过吸入，优选地每周至少一次和/或持续至少4周，将两者施用于患者。

69、在一些实施例中，所述药物组合物包含可以被翻译成两种或更多种蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸。这可以例如使用多顺反子多核糖核苷酸来完成，多顺反子多核糖核苷酸是编码两种或更多种不同蛋白的单个多核糖核苷酸。使用例如2a肽设计这样的多顺反子多核糖核苷酸在文献中已有详细描述。作为示例，liu等人证明了使用2a肽来产生多顺反子mrna(liu等人,2017,《科学报告(scientific reports)》,7:2193)。这些2a肽可以进一步与例如弗林蛋白酶(furin)切割位点结合，以除去由于核糖体跳跃(2a肽的功能特征)而附接到序列中第一蛋白上的附加氨基酸(2a肽的一部分)。作为示例，例如chng等人(chng等人,2015《单克隆抗体(mabs)》,7(2):403-412)已经描述了使用2a肽进行弗林蛋白酶裂解的用途。因此，可以设计编码两种或更多种，优选地两种治疗性蛋白(例如ccdc40和mcidas)的单个多核糖核苷酸，其中两种治疗性蛋白的编码区被2a肽分开(如以上引用中所述)。

70、因此，在一些实施例中，除了药物组合物包含可以被翻译成两种或更多种，优选地两种蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸之外，与上述实施例所描述的相同。因此，在一些实施例中，如在上述实施例中所述的药物组合物包含多顺反子多核糖核苷酸，多顺反子多核糖核苷酸包含可以被翻译成蛋白的功能性版本的序列和可以被翻译成mcidas蛋白的功能性版本的序列，该蛋白选自由以下组成的群组：dnah5、dnah11、ccdc39、dnai1、ccdc40、ccdc103、spag1、zmynd10、armc4、ccdc151、dnai2、rsph1、ccdc114、rsph4a、dnaaf1(lrrc50)、dnaaf2(ktu)和lrrc6，优选地ccdc40和/或ccdc39。

71、在一些实施例中，所述药物组合物包含可以被翻译成mcidas蛋白的功能性版本且包含如seq id no:4所示的优化的多核糖核苷酸序列的多核糖核苷酸，以及可以被翻译成ccdc40和/或ccdc39蛋白的功能性版本且包含如seq id no:1(或seq id no:5-11)和/或seq id no:2(或seq id no:12-14)所示的优化的多核糖核苷酸序列的多核糖核苷酸。优选地，通过使用鼻喷雾剂和/或雾化器，和/或通过吸入，优选地每周至少一次和/或持续至少4周，将药物组合物施用于患者。

72、作为mcidas的替代或补充，例如可以使用gemc1、foxj1和/或e2f4vp16。gemc1在纤毛上皮中被特异性地表达并且是纤毛生成的中枢调节因子。据报道，gemc1的异位表达足以通过上调mcidas和foxj1(多纤毛形成的两种关键转录调节因子)在气道上皮细胞中离体诱导多纤毛形成的早期步骤(arbi m等人,2016,《embo报告(embo reports)》,17(3):400-413)。此外，在同一研究中还报道了gemc1可以直接反式激活mcidas和foxj1上游调控序列。e2f4vp16是指e2f4的一种形式，其包含来自hsv1 vp16的通用激活结构域，并且可以对与多纤毛形成相关的关键基因的表达的激活产生积极影响(kim s等人,《科学报告(scientificreports)》,2018,8:12369)。

73、因此，在用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物的一些实施例中，药物组合物是如上所述的第一药物组合物，并且进一步包含以下中的至少一种：编码mcidas蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸、编码gemc1蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸、编码foxj1蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸，和/或编码e2f4vp16蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸。

74、在药物组合物的一些实施例中，如上所述的第一药物组合物可以与第二药物组合物一起施用，第二药物组合物包含以下中的至少一种：编码mcidas蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸、编码gemc1蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸、编码foxj1蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸，和/或编码e2f4vp16蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸。

75、两种药物组合物(即如上定义的进一步包含编码mcidas、gemc1、foxj1和/或e2f4vp16蛋白的多核糖核苷酸的第一药物组合物，或与包含编码mcidas、gemc1、foxj1和/或e2f4vp16蛋白的多核糖核苷酸的第二药物组合物一起施用的第一药物组合物)都是有利的，因为当在细胞开始纤毛形成之前或当它们处于纤毛形成时将药物组合物施用于细胞时，根据本发明的药物组合物的施用在恢复纤毛细胞结构和功能方面特别有效。进一步地，优选地通过使用鼻喷雾剂和/或雾化器和/或通过吸入，优选地每周至少一次和/或持续至少4周，将两者施用于患者。

76、如上所述，在一些实施例中，除了药物组合物包含可以被翻译成两种或更多种，优选地两种蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸之外，与上述实施例所述相同。因此，在一些实施例中，如在上述实施例中所述的药物组合物包含多顺反子多核糖核苷酸。

77、所述药物组合物可以包含促进用多核糖核苷酸转染细胞的化合物。这类化合物的示例是在wo 2014/20723中公开的那些。

78、所述药物组合物可以进一步包含一种或多种剂或一种或多种试剂，用于将rna递送和/或引入到靶细胞或靶组织中。特别地，设想这一/这些剂或试剂支持将rna递送和/或引入到细胞或组织中。这一或这些剂或试剂可以与rna一起被施用。待递送/引入的rna也可以与这一/这些剂偶联(例如，与这一/这些药剂共价结合或络合)或解偶联(例如仅与这一/这些药剂混合)。相应的剂或试剂是本领域已知的(例如，tavernier,《控制释放杂志(jcontrol release)》150(3)(2011),238-47)，并且例如选自由以下组成群组：脂质和脂质体、胶束、聚合物和树枝状聚合物等。相应的剂或试剂的具体示例是gl67、edmpc、l,2-二油烯基-3-三甲基铵丙烷(dotap)、1,2-二油烯基-3-三甲基铵丙烷(dodap)、l,2-二-o-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(dotma)、2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基乙基-[l,3]-二氧戊环(xtc)和((6z,9z,28z,31z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(mc3)、(3ar,5s,6as)-n,n-二甲基-2,2-二((9z,12z)-十八烷基-9,12-二烯基)四氢-3ah-环戊并[d][1,3]二氧戊环-5-胺)(alny-100)、4,7,13-三(3-氧代-3-(十一烷基氨基)丙基)-nl,n16-双十一基-4,7,10,13-四氮杂十六烷-l,16-二胺(nc98-5)、c12-200、dlin-kc2-dma、dodap、l,2-二硬脂氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷或“dsdm”、l,2-二油烯基氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷或“dodma”、l,2-二亚油烯基氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷或“dlindma”、1,2-二亚油烯基氧基-n,n-二甲基-3-氨基丙烷或“dlendma”、n-二油烯基-n,n-二甲基氯化铵或“dodac”、n,n-二硬脂基-n,n-二甲基溴化铵或“ddab”、n-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-n,n-二甲基-n-羟基乙基溴化铵或“dmrie”、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧丁烷-4-氧基)-l-(顺,顺-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷或“clindma”、2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基l-l-(顺,顺-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷或“cplindma”、n,n-二甲基-3,4-二油烯基氧基苄胺或“dmob”、l,2-n,n'-二油烯基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“docarbdap”、2,3-二亚油烯基氧基-n,n-二甲基丙胺或“dlindap”、l,2-n,n'-二亚油烯基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“dlincarbdap”、l,2-二亚油烯基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“dlincdap”、2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基甲基-[l,3]-二氧戊环或“dlin-k-dma”、2,2-二亚油烯基-4-二甲基氨基乙基-[l,3]-二氧戊环或“dlin-k-xtc2-dma”或其混合物(heyes,《控制释放杂志(j controlled release)》107(2005),276-287；morrissey,《自然生物技术(nat.biotechnol.)》23(8)(2005),1003-1007；wo2005/121348)。进一步的示例是n,n-二甲基-n-乙基羧酰胺基胆甾醇(dc-chol)、l,4-双(3-n-油烯基氨基-丙基)哌嗪(gao,《生物化学和生物物理研究通讯(biochem.biophys.res.comm.)》179(1991),280；wolf等人,《生物技术(biotechniques)》23(1997),139；美国专利第5,744,335号)。进一步的示例是lipofectin(dotma:dope)(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(invitrogen))、lipofectamine(dospa:dope)(英杰公司)、lipofectamine2000.(英杰公司)、fugene、transfectam(dogs)和effectene。进一步的示例是改性的和未改性的聚丙烯酸酯、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚交酯、聚交酯-聚乙交酯共聚物、聚己内酯、葡聚糖、白蛋白、明胶、藻酸盐、胶原、壳聚糖、环糊精、聚赖氨酸、聚精氨酸、寡胺/多胺和聚乙烯亚胺。

79、剂或试剂可以是低聚物、聚合物或类脂质。它们可以包含低聚(亚烷基胺)部分，如例如在pct/ep2014/063756中所描述的特征性低聚(亚烷基胺)部分。特别地，剂或试剂可以是在pct/ep2014/063756中所描述的低聚物、聚合物或类脂质。这些特定剂或试剂的一个主要特征是它们含有下式(i)的共同结构实体：

80、

81、这样的剂或试剂可以是选自以下的低聚(亚烷基胺)(包含其的组分)：

82、a)包含式(ii)的多个基团作为侧链和/或作为端基的低聚物或聚合物：

83、

84、其中独立地针对多个这样的基团中的式(ii)的每个基团，变量a、b、p、m、n和r2至r6定义如下：

85、a是1，并且b是2到4的整数；或者a是2到4的整数，并且b是1，

86、p是1或2，

87、m是1或2；n为0或1，并且m+n为≥2；并且

88、r2至r5彼此独立地选自氢；基团-ch2-ch(oh)-r7、-ch(r7)-ch2-oh、-ch2-ch2-(c＝o)-o-r7、-ch2-ch2-(c＝o)-nh-r7或-ch2-r7，其中r7选自具有一个c-c双键的c3-c18烷基或c3-c18烯基；氨基的保护基团；和聚(乙二醇)链；

89、r6选自氢；基团-ch2-ch(oh)-r7、-ch(r7)-ch2-oh、-ch2-ch2-(c＝o)-o-r7、-ch2-ch2-(c＝o)-nh-r7或-ch2-r7，其中r7选自具有一个c-c双键的c3-c18烷基或c3-c18烯基；氨基的保护基团；-c(nh)-nh2；聚(乙二醇)链；和受体配体，

90、并且其中式(ii)所示的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供式(ii)的阳离子基团；

91、b)包含式(iii)的多个基团作为重复单元的低聚物或聚合物：

92、

93、其中独立地针对多个这样的基团中的式(iii)的每个基团，变量a、b、p、m、n和r2至r5定义如下：

94、a是1，并且b是2到4的整数；或者a是2到4的整数，并且b是1，

95、p是1或2，

96、m是1或2；n为0或1，并且m+n为≥2；并且

97、r2至r5彼此独立地选自氢；基团-ch2-ch(oh)-r7、-ch(r7)-ch2-oh、-ch2-ch2-(c＝o)-o-r7或-ch2-ch2-(c＝o)-nh-r7或-ch2-r7，其中r7选自具有一个c-c双键的c3-c18烷基或c3-c18烯基；氨基的保护基团；-c(nh)-nh2；和聚(乙二醇)链；

98、并且其中式(iii)所示的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供式(iii)的阳离子基团；以及

99、c)具有式(iv)结构的类脂质：

100、

101、其中变量a、b、p、m、n和r1到r6定义如下：

102、a是1，并且b是2到4的整数；或者a是2到4的整数，并且b是1，

103、p是1或2，

104、m是1或2；n为0或1，并且m+n为≥2；并且

105、r1到r6彼此独立地选自氢；基团-ch2-ch(oh)-r7、-ch(r7)-ch2-oh、-ch2-ch2-(c＝o)-o-r7、-ch2-ch2-(c＝o)-nh-r7或-ch2-r7，其中r7选自具有一个c-c双键的c3-c18烷基或c3-c18烯基；氨基的保护基团；-c(nh)-nh2；聚(乙二醇)链；以及受体配体；条件是r1至r6中至少两个残基是基团-ch2-ch(oh)-r7、-ch(r7)-ch2-oh、-ch2-ch2-(c＝o)-o-r7、-ch2-ch2-(c＝o)-nh-r7或-ch2-r7，其中r7选自具有一个c-c双键的c3-c18烷基或c3-c18烯基；

106、并且其中式(iv)所示的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供式(iv)的阳离子类脂质。

107、优选地，这样的剂或试剂可以是选自a)和b)的低聚(亚烷基胺)(包含其的组分)，其中

108、a)是包含式(iia)的多个基团作为侧链和/或作为端基的低聚物或聚合物：

109、-nr2{ch2-(ch2)a-nr3-ch2-(ch2)b-nr4}m-[ch2-(ch2)a-nr5]n-r6(iia),

110、其中a、b、m、n和r2至r6如上所述定义，并且其中式(iia)中所示的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供阳离子低聚物或聚合物结构；和

111、b)是包含式(iiia)的多个基团作为重复单元的低聚物或聚合物：

112、-nr2{ch2-(ch2)a-nr3-ch2-(ch2)b-nr4}m-[ch2-(ch2)a-nr5]n-(iiia),

113、其中a、b、m、n和r2至r5如上所述定义，并且其中式(iiia)中所示的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供阳离子低聚物或聚合物结构。

114、此外，这样的剂或试剂可以是选自具有式(iva)的结构的类脂质的低聚(亚烷基胺)(包含其的组分)：

115、r1-nr2{ch2-(ch2)a-nr3-ch2-(ch2)b-nr4}m-[ch2-(ch2)a-nr5]n-r6(iva),

116、其中a、b、m、n和r1至r6如上所述定义，并且其中式(iva)中所示的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供阳离子类脂质。

117、关于这样的剂或试剂，在式(ii)、(iia)、(iii)、(iiia)、(iv)或(iva)中，n可以是1；或者m可以是1，并且n可以是1。

118、进一步地，关于这样的剂或试剂，在式(ii)、(iia)、(iii)、(iiia)、(iv)或(iva)中，a可以是1，并且b可以是2；或者a可以是2，并且b可以是1。

119、在一些实施例中，低聚物、聚合物或类脂质可以是阳离子(例如质子化的)低聚物、聚合物或类脂质。

120、待使用的这种低聚物、聚合物或类脂质的一个非限制性示例是阳离子脂质，其通过将100mg的n,n'-双(2-氨基乙基)-1,3-丙二胺(0.623mmol)与575.07mg的1,2-环氧十二烷(3.12mmol，(n-1)当量，其中n是每种低聚(亚烷基胺)2倍量的伯胺加上1倍量的仲胺)混合来制备，并在80℃下在持续摇晃下混合96小时。这种低聚物、聚合物或类脂质也被称为类脂质“c12-(2-3-2)”。

121、待使用的剂或试剂(特别地聚合物)可以是共聚物，特别地统计共聚物。这种共聚物可以是包含交替长度的亚烷基胺重复单元的统计/无规排列的共聚物(例如，与包含非交替长度的亚烷基胺重复单元的类似排列的不太优选的聚合物相反)。共聚物可以是阳离子(例如质子化的)共聚物。待使用的共聚物是本领域已知的，并且例如描述于ep 14 199439.2、wo 01/00708、ep-a1 1 198 489和ca-a1 2,377,207中。

122、特别地，所述共聚物可以是包含独立地选自下式(a1)和(a2)的重复单元的多个重复单元(a)的统计共聚物：

123、-ch2-ch2-nh-  (a1)

124、

125、独立地选自下式(b1)至(b4)的重复单元的多个重复单元(b)：

126、-ch2-ch2-ch2-nh-  (b1)

127、

128、-ch2-ch2-ch2-ch2-nh-  (b3)

129、

130、其中重复单元(a)的总和与重复单元(b)的总和的摩尔比在0.7/1.0至1.0/0.7的范围内，并且

131、其中共聚物中包含的重复单元(a)和/或(b)的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供阳离子共聚物。

132、共聚物可以是统计共聚物，其中任何重复单元(a)和任何重复单元(b)被统计地分布在共聚物大分子中。它通常由在聚合反应期间产生重复单元(a)的单体与在聚合反应过期间产生重复单元(b)的单体的混合物的共聚获得。优选地，共聚物是无规共聚物，其中任何重复单元(a)和任何重复单元(b)被随机地分布在聚合物大分子中。

133、这种共聚物可以是线性、支化或树枝状共聚物。如本领域技术人员将理解的，具有两个价态(即与相邻单元的开放键)的式(a1)、(b1)或(b3)的重复单元导致共聚物结构以线性方式传播。因此，线性共聚物可以包含式(a1)的重复单元和一种或多种类型的式(b1)和(b3)的重复单元，但不包含式(a2)、(b2)或(b4)的重复单元。如将进一步理解的，具有三个价态的式(a2)、(b2)或(b4)的重复单元的存在在共聚物结构中提供了分支点。因此，支化共聚物包含一种或多种类型的式(a2)、(b2)和(b4)的重复单元，并且可以进一步包含一种或多种类型的式(a1)、(b1)和(b3)的重复单元。

134、这种共聚物可以包含独立地选自以上定义的式(a1)和(a2)的重复单元的多个重复单元(a)和独立地选自以上定义的式(b1)至(b4)的重复单元的多个重复单元(b)。优选的是包含独立地选自以上定义的式(a1)和(a2)的重复单元的多个重复单元(a)和独立地选自以上定义的式(b1)和(b2)的重复单元的多个重复单元(b)的共聚物。

135、优选地，这种共聚物是这样的支化共聚物，其包含一种或多种类型的选自重复单元(a2)、(b2)和(b4)的重复单元，并且任选地进一步包含一种或多种类型的式(a1)、(b1)和(b3)的重复单元，并且特别地是这样的共聚物，其包含式(a2)的重复单元和一种或多种类型的式(b2)和(b4)的重复单元，并且任选地进一步包含一种或多种类型的式(a1)、(b1)和(b3)的重复单元。与上述相符，更优选的共聚物因此是这样的支化共聚物，其包含式(a2)的重复单元和式(b2)的重复单元，并且任选地进一步包含一种或多种类型的式(a1)和(b1)的重复单元。

136、在共聚物中，重复单元(a)和重复单元(b)的总数通常为20或更多，优选地50或更多，并且更优选地100或更多。通常，重复单元(a)和重复单元(b)的总数为10,000或更少，优选地5,000或更少，更优选地1,000或更少。

137、此外，对于共聚物，优选的是重复单元(a)和(b)占共聚物中所有重复单元的80摩尔％或更多，更优选地90摩尔％或更多。进一步优选的是这样的共聚物，其中选自(a1)和(a2)的重复单元(a)和选自(b1)和(b2)的重复单元(b)占共聚物中所有重复单元的80摩尔％或更多，更优选地90摩尔％或更多。最优选的是，共聚物中的所有重复单元是重复单元(a)或(b)，特别地共聚物中的所有重复单元是选自(a1)和(a2)的重复单元(a)或选自(b1)和(b2)的重复单元(b)。

138、共聚物的重均分子量(如通过例如尺寸排阻色谱法相对于线性聚(环氧乙烷)标准品测量的)通常在1,000至500,000da的范围内，优选地在2,500至250,000da的范围内，并且更优选地5,000-50,000更低。

139、这种共聚物的端基通常包含一种或多种类型的独立地选自下式(c1)至(c3)的基团的基团(c)，优选地选自下式(c1)和(c2)的基团的基团(c)：

140、-ch2-ch2-nh2(c1)

141、-ch2-ch2-ch2-nh2(c2)

142、-ch2-ch2-ch2-ch2-nh2(c3)。

143、优选地，共聚物中的端基由一种或多种类型的独立地选自下式(c1)至(c3)的基团(优选地选自下式(c1)和(c2)的基团)的基团(c)组成。如本领域技术人员将理解的，端基的数目取决于共聚物的结构。虽然线性共聚物只有两个端基，但在支化共聚物中，特别地在树枝状共聚物中含有更多数目的端基。如将进一步理解的，共聚物中包含的端基(c)的氮原子中的一个或多个也可以被质子化以提供阳离子共聚物。

144、在共聚物中，重复单元(a)的总和与重复单元(b)的总和的摩尔比在0.7/1.0至1.0/0.7的范围内，并且优选地在0.8/1.0至1.0/0.8的范围内。这一摩尔比可以通过例如nmr来确定。因此将理解，该比率通常是针对共聚物的多种大分子确定的，并且通常表示在多种大分子中重复单元(a)的总和与重复单元(b)的总和的总比率。

145、如上所述，共聚物的氮原子中的一个或多个可以被质子化以产生阳离子形式(通常是低聚阳离子或聚阳离子形式)的共聚物。应当理解，重复单元(a)或(b)中或端基(c)中的伯、仲或叔氨基可以充当质子受体，特别是在水和水溶液(包括生理流体)中。因此，这样的共聚物在7.5或以下的ph的水溶液中通常具有总正电荷。如本文所指的，水溶液是其中溶剂包含50％(体积/体积)或更多、优选地80％或90％或更多并且最优选地100％水的溶液。而且，如果组合物与ph为7.5或以下的生理流体(包括例如血液和肺液)接触，则它们通常含有重复单元(a)和(b)，其中氮原子被质子化。组合物中使用的共聚物的pka值可以通过使用自动pka滴定仪的酸碱滴定来测定。然后可以根据例如亨德森-哈塞尔巴赫公式计算给定ph值下的净电荷。任何电荷都可以在数个碱中心之间共享，并且不一定可以归因于单一的点。通常，在生理ph的溶液中，组合物中使用的共聚物包含具有处于质子化状态的氨基的重复单元和具有处于非质子化状态的氨基的重复单元。

146、然而，如本领域技术人员将理解的，共聚物以及组合物也可以以包含阳离子形式的共聚物的干盐形式提供。

147、如将进一步理解的，在包含共聚物和核酸(特别是rna，优选地单链rna，如mrna)的组合物中质子化氨基的正电荷的抗衡离子(阴离子)通常由包含在核酸中的阴离子部分提供。如果与核酸中的阴离子部分相比，带正电荷的基团过量存在，则正电荷可以被其他阴离子平衡，特别是通常在生理流体中遇到的那些阴离子，诸如cl-或hco3-。

148、根据上述，优选的共聚物是无规共聚物，其中

149、所有重复单元中的80摩尔％或更多(更优选地所有重复单元)通过以下来形成

150、独立地选自下式(a1)和(a2)的重复单元的多个重复单元(a)：

151、-ch2-ch2-nh-  (a1)

152、

153、独立地选自下式(b1)和(b2)的重复单元的多个重复单元(b)：

154、-ch2-ch2-ch2-nh-(b1)

155、

156、其中重复单元(a)的总和与重复单元(b)的总和的摩尔比在0.7/1.0至1.0/0.7的范围内，更优选地在0.8/1.0至1.0/0.8的范围内；

157、其中所述共聚物的端基通过以下来形成

158、独立地选自式(c1)和(c2)的基团的基团(c)：

159、-ch2-ch2-nh2(c1)

160、-ch2-ch2-ch2-nh2(c2)；并且

161、其中共聚物中包含的重复单元(a)和/或(b)和/或端基(c)的氮原子中的一个或多个可以被质子化以提供阳离子共聚物。进一步优选的是，共聚物是支化共聚物，其包含单元(a2)和(b2)，任选地与单元(a1)和/或(b1)一起。

162、共聚物可以方便地用类似于制备聚亚烷基亚胺(如支化或线性聚乙烯亚胺(pei))的已知程序来制备。将理解，用于生产共聚物的单体将必须相应地进行调整。在本文中，已经发现，单体可以方便地以定量方式反应，使得共聚物中单元(a)和(b)的比率可以通过相应地调节经历聚合的单体混合物中的单体比率来调节。虽然聚乙烯亚胺可以通过例如氮丙啶的开环聚合来制备，但是共聚物可以通过单体混合物的开环聚合来制备，单体混合物包含或由氮丙啶、氮杂环丁烷和(适用时)吡咯烷，或在优选的实施例中氮丙啶和氮杂环丁烷组成。将理解，表述“适用时”是指重复单元(b3)和(b4)或端基(c3)的存在或不存在，它们将由吡咯烷形成。未取代的环胺的开环聚合通常产生支化共聚物。线性共聚物可以例如通过合适的n-取代的氮丙啶、n-取代的氮杂环丁烷和n-取代的吡咯烷，或n-取代的氮丙啶和n-取代的氮杂环丁烷的聚合来制备，随后可以例如水解裂解附接到所得聚亚烷基亚胺链上的n-取代基，例如类似于在katrien f.weyts,eric j.goethals,“线性聚乙烯亚胺的新合成(new synthesis of linear polyethyleneimine)”,《聚合物通报(polymer bulletin)》,1988,19(1):13-19中公布的程序。树枝状聚合物可以根据例如yemul等人，《胶体和聚合物科学(colloid and polymer science)》，2008,286(6-7):747-752，“聚(乙烯亚胺)树枝状聚合物的合成和表征(synthesis and characterization of poly(ethylenimine)denrimers)”中描述的方法来合成。

163、对于树枝状聚合物(或树枝状共聚物)的制备，可以类似地应用已知用于生产聚乙烯亚胺或聚丙烯胺树枝状聚合物的合成策略。可以使用伯胺的迈克尔加成的重复序列，然后进行非均相催化氢化(newkome和shreiner“具有不同1→2分支基序的聚(酰胺基胺)、聚丙烯亚胺以及相关树枝状聚合物和树枝状大分子单元：扩散法概述(poly(amidoamine),polypropylenimine,and related dendrimers and dendrons possessing different 1→2branching motifs:an overview of the divergent procedures)”.《聚合物(polymer)》49(2008)1-173；de brabander-van den berg等人,“聚丙烯亚胺树枝状聚合物的大规模生产(large-scale production of polypropylenimine dendrimers)”,《高分子研讨会(macromolecular symposia)》(1994)77(1)51-62)，由丙烯腈结构单元来合成聚丙烯亚胺树枝状聚合物。聚乙烯亚胺树枝状聚合物可以使用乙烯基溴化物结构单元迈克尔加成到伯胺上的重复序列，随后使用gabriel胺合成方法将烷基溴化物转化为胺来生产(yemul&imae，“聚(乙烯亚胺)树枝状聚合物的合成与表征(synthesis andcharacterization of poly(ethyleneimine)dendrimers)”,《胶体聚合物科学(colloidpolym sci)》(2008)286:747-752)。因此，本领域技术人员将不仅能够生产具有例如丙烯亚胺和乙烯亚胺的严格交替层的树枝状聚合物。类似地，可以产生具有包含或由式(a2)、(b2)和(b4)的重复单元并且优选地重复单元(a2)和(b2)的无规组合物组成的层的树枝状聚合物代。

164、氮丙啶和氮杂环丁烷，或氮丙啶、氮杂环丁烷和吡咯烷的开环聚合可以在溶液中(例如在水中)进行。总单体浓度没有特别的限制，典型的浓度范围为10％wt/wt至80％wt/wt，优选地30％wt/wt至60％wt/wt。通常，聚合由质子引发，使得优选向反应体系中加入布朗斯特酸( acid)，特别是无机酸，如硫酸。基于单体的总浓度，少量的酸通常是足够的，如0.001至0.01当量。反应以方便的速率进行，例如在50-150℃，特别是90-140℃的温度范围内进行。在这些范围内，较高分子量的共聚物通常处于较高的温度，而较低分子量的共聚物处于较低的温度。

165、原则上，类脂质是优选的待使用的剂或试剂，特别地与低聚物相比，并且更特别地与聚合物相比。

166、用于将rna递送和/或引入到靶细胞或靶组织中的一种或多种剂或一种或多种试剂的进一步的示例是如本文别处所述的脂质体转染试剂(ltr)和磁性颗粒(mp)。

167、用于将rna递送和/或引入到靶细胞或靶组织中的一种特定模式是转染。因此，可以设想待使用的rna被转染(到(靶)细胞或组织中)，通过转染被递送/施用和/或被制备用于转染。用于转染rna的手段和方法是本领域熟知的，并且例如，在tavernier(loc.cit.),yamamoto(《欧洲药剂学和生物药剂学杂志(eur j pharm biopharm.)》71(3)(2009),484-9)和kormann(《自然生物技术》.29(2)(2011),154-7)中描述。特定的转染模式为脂转染、磁转染或磁脂转染。

168、因此，待使用的rna可以被制备用于脂转染，被制备用于通过脂转染被转染，通过脂转染被递送/引入和/或通过脂转染被施用。

169、因此，药物组合物可以(进一步)包含至少一种脂质或脂质体转染试剂或增强剂(ltr；脂质体转染试剂)。待使用的rna可能被包含在ltr中、与ltr复合和/或由ltr递送。特别地，待使用的rna可以被包含在包含rna和ltr的(各自的)脂转染复合物中和/或由其递送。药物组合物可以(进一步)包含脂转染复合物。

170、ltr是本领域已知的，并例如由法国马赛的ozbiosciences分销。待使用的ltr可以选自由上述用于将rna递送和/或引入到靶细胞或靶组织中的剂或试剂组成的群组。例如，这样的ltr可以是脂质或类脂质，优选地阳离子脂质或阳离子类脂质，如在pct/ep2014/063756中公开的类脂质(例如，c12-(2-3-2)，如在ep2285772中公开的脂质(例如dogtor)和如在ep1003711中公开的脂多胺(例如dreamfecttm和dreamfect goldtm)。特定的ltr可以选自由以下组成的群组：

171、(i)c12-(2-3-2)；

172、(ii)dreamfecttm，优选地dreamfect goldtm(dftm/df-goldtm；ozbiosciences，法国马赛)；

173、(iii)dogtor(ozbiosciences，法国马赛)；以及

174、(iv)lipofectamine，例如如lipofectamine 2000(美国加利福尼亚州的invitrogene)。

175、原则上，dogtor是优选的药物，dreamfecttm是更优选的药物，并且df-goldtm和c12-(2-3-2)是甚至更优选的ltr。

176、例如，在ep2285772中描述了如dogtor的ltr。例如，在ep1003711中描述了如dftm或df-goldtm的ltr。原则上，如在pct/ep2014/063756中公开的低聚物、聚合物或类脂质，如在ep2285772中公开的特定阳离子脂质和如在ep1003711中公开的特定脂多胺是优选的ltr。如c12-(2-3-2)和df-goldtm的ltr是最优选的。

177、脂感染复合物的非限制性示例为df-goldtm/rna脂质复合物(lipoplex)和c12-(2-3-2)/rna脂质复合物。

178、c12-(2-3-2)是特别优选的具有式(v)所示的结构的ltr(参见等人,《应用化学国际版》,2016；55(33):9591-5)：

179、

180、c12-(2-3-2)优选地如例如wo 2016/075154 a1、ep 3013964和等人,(《应用化学国际版》,2016；55(33):9591-5)所述的制备。阳离子类脂质可以通过将n1-(2-氨基乙基)-n3-(2-((3,4-二甲氧基苄基)氨基)乙基)丙烷-1,3-二胺(8.9g，1当量，28.67mmol)与1,2-环氧十二烷(42.27，8当量，229.4mmol)混合来制备，并在80℃下在持续摇晃下混合24小时，然后纯化并除去3,4-二甲氧基苄基保护基团。

181、可以使用c12-(2-3-2)的不同异构体，如外消旋体、s异构体和/或r异构体。优选地，c12-(2-3-2)被用作纯r异构体并且具有式(vi)所示的结构。为了获得c12-(2-3-2)的纯r异构体，可以如上面关于c12-(2-3-2)所描述的，使用1,2-环氧十二烷的r异构体进行合成来制备。

182、

183、因此，在优选的实施例中，所述药物组合物包含用于治疗纤毛疾病的多核糖核苷酸，并且进一步包含具有式(v)所示的结构的类脂质，优选地如式(vi)所示。

184、进一步特别优选的ltr是具有式(vii)的阳离子类脂质，在本文中也被称为“dl_p”，其可以通过使用硼酸作为催化剂使n,n'-双(2-氨基乙基)-1,3-丙二胺与n-十二烷基丙烯酰胺反应来合成。对于反应，可以在100℃下在微波辐射下搅拌混合物。

185、因此，在进一步优选的实施例中，药物组合物包含用于治疗纤毛疾病的多核糖核苷酸，并且进一步包含具有式(vii)所示的结构的类脂质。

186、

187、此外，所述药物组合物包含具有式(v)、(vi)和/或(vii)的阳离子类脂质，优选地dl_p和/或c12-(2-3-2)，更优选地dl_p和/或c12-(2-3-2)的r异构体，其包含在如下所述的制剂中。特别地，本文所述的用于将rna递送和/或引入到靶细胞或靶组织中的剂和试剂以及本文所述的ltr可以与一种或多种(例如，两种、三种或四种)进一步的脂质(例如，胆固醇、dppc、dope和/或peg-脂质(例如，dmpe-peg、dmg-peg2000))组合。这些进一步的脂质可以支持剂/试剂和ltr的期望功能(分别支持和/或增加rna到细胞或组织中的递送和/或引入并提高转染效率)，并且作为各自的“辅助脂质”。此类“辅助脂质”的具体示例为胆固醇、dppc、dope和/或peg-脂质(例如，dmpe-peg、dmg-peg(例如，dmg-peg2000))。进一步的脂质(例如，“辅助脂质”)也可以是本文公开的复合物/颗粒的部分(一个或多个)。本领域技术人员能够容易地制备根据本发明的复合物/颗粒。进一步的脂质(例如“辅助脂质”)的示例在本领域中也是已知的。本领域技术人员能够容易地选择合适的进一步的脂质(例如“辅助脂质”)以及剂/试剂/ltr与进一步的脂质(例如“辅助脂质”)的比率。这样的比率可以是剂/试剂/ltr:进一步的脂质的1-4:1-5、3-4:4-6、约4:约5、约4:约5.3的摩尔比(更窄的范围是优选的)。例如，剂/试剂/ltr可以与三种进一步的脂质如dppc、胆固醇和dmg-peg2000以分别为8:5.3:4.4:0.9，或更特别地分别为8:5.29:4.41:0.88的摩尔比组合。

188、优选地，如上所述产生dl_p和/或c12-(2-3-2)，更优选地dl_p和/或c12-(2-3-2)的r异构体，并与辅助脂质dppc和胆固醇以及peg-脂质dmg-peg2000一起以8:5.29:4.41:0.88的摩尔比用于配制脂质颗粒。

189、其中将c12-(2-3-2)(式vi)的r异构体与脂质dppc和胆固醇以及peg-脂质dmg-peg2000以8:5.29:4.41:0.88的摩尔比配制的组合物在本文中也被称为“lf92”。其中dl_p(式vii)与脂质dppc和胆固醇以及peg-脂质dmg-peg2000以8:5.29:4.41:0.88的摩尔比配制的组合物在本文中也被称为“lf111”。

190、如也在例如wo 2016/075154 a1、ep 3013964和zhang等人(termis,2019,《组织工程：a部分(tissue engineering:part a)》,第25卷,1和2期)中示例性描述的，dl_p和/或c12-(2-3-2)可以用作非病毒载体，以基于mrna分子的类脂质的正氨基和mrna分子的负磷酸基团之间的静电相互作用与mrna分子形成稳定的脂质复合物(anderson,《人类基因疗法(human gene therapy)》14,2003,191-202)。为了稳定脂质复合物结构和减少泄漏，可以向dl_p和/或c12-(2-3-2)，更优选地dl_p和/或c12-(2-3-2)的r异构体提供有两种辅助脂质，名为1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)和胆固醇(anderson,《药物递送(drugdelivery)》11,2004,33-39；liang,《胶体和界面科学杂志(journal of colliod andinterface science)》278,2004,53-62)。最后，将1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(dmg-peg)2kd(dmg-peg2000)加入到脂质混合物中，以提供聚乙二醇化脂质体。已经熟知的是，聚乙二醇化通过增加水溶性、防止酶促降解以及限制免疫原性和抗原性反应来改善脂质体制剂的物理化学特性(milla,《当前的药物代谢(current drug metabolism)》13,2012,105-119)。整个乙醇脂质混合物的最终n/p比率为8:5.29:4.41:0.88，其代表dl_p和/或c12-(2-3-2)/dppc/胆固醇/dmg-peg2000的氨基分别与mrna分子的一个磷酸基团的摩尔比。

191、因此，在优选的实施例中，用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物进一步包含用dppc、胆固醇和dmg-peg2000配制的dl_p和/或c12-(2-3-2)，优选地dl_p和/或c12-(2-3-2)的r异构体。

192、此外，在特别优选的实施例中，用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的所述药物组合物进一步包含用dppc、胆固醇和dmg-peg2000配制的dl_p和/或c12-(2-3-2)，优选地dl_p和/或c12-(2-3-2)的r异构体，其中对于dl_p和/或c12-(2-3-2)/dppc/胆固醇/dmg-peg2000的氨基分别与mrna分子的一个磷酸基团的摩尔比，整个乙醇脂质混合物的最终n/p比率为8:5.29:4.41:0.88。

193、如上所述，与dppc、胆固醇和dmg-peg2000一起配制的c12-(2-3-2)的r异构体也被称为lf92制剂。

194、因此，在用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物的特别优选的实施例中，所述药物组合物进一步包含lf92制剂。

195、如上所述，用dppc、胆固醇和dmg-peg2000一起配制的dl_p也被称为lf111制剂。

196、因此，在用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物的特别优选的实施例中，所述药物组合物进一步包含lf111制剂。

197、在用于治疗纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物的优选实施例中，所述药物组合物进一步包含lf92和/或lf111制剂。lf92和/或lf111是指用于细胞转染的载体制剂。这是有利的，因为lf92和/或lf111的使用与高转染效率相关联，并且因此确保编码其缺陷与纤毛疾病相关的蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸可以有效地进入细胞，优选地未分化的纤毛细胞或基底细胞，并且因此在患有pcd的受试者中恢复纤毛细胞功能。

198、在一个特别优选的实施例中，所述药物组合物包含lf92和/或lf111制剂、下列中的至少一种：可以被翻译成mcidas蛋白的功能性版本的mrna、可以被翻译成gemc1蛋白的功能性版本的mrna、可以被翻译成foxj1蛋白的功能性版本的mrna、可以被翻译成e2f4vp16蛋白的功能性版本的mrna以及可以被翻译成ccdc40和/或ccdc39的功能性版本的mrna。优选地，通过使用喷雾剂、液滴和/或雾化器和/或通过吸入，优选地每周至少一次和/或持续至少4周，将这样的组合物施用于患者。

199、因此，在一些实施例中，除了所述药物组合物包含可以被翻译成两种或更多种，优选地两种蛋白的功能性版本的多核糖核苷酸之外，与上述实施例所述相同。因此，在一些实施例中，如在上述实施例中所述的药物组合物包含多顺反子多核糖核苷酸。

200、本发明还涉及一种治疗患有纤毛疾病的受试者的纤毛疾病的方法，方法包括施用包含多核糖核苷酸的药物组合物，其中多核糖核苷酸编码其缺陷与所述纤毛疾病相关的蛋白的功能性版本，并且其中所述药物组合物被施用至所述受试者的呼吸系统并且当受试者表现出呼吸系统的炎症时起作用。关于药物组合物的可能的实施例和优选的实施例及其施用的方式和时间，与上文关于根据本发明的药物组合物所述相同。

201、本发明还涉及一种药物组合物，其包含编码其缺陷与纤毛疾病相关的蛋白的多核糖核苷酸和n-乙酰半胱氨酸(nac)、包含氯化钠的高渗溶液和/或lf92和/或lf111制剂。

202、关于药物组合物和其组分，与上述关于用于治疗患有纤毛疾病的受试者的纤毛疾病的包含多核糖核苷酸的药物组合物的描述相同。此外，这种药物组合物的其他特征也可以如上所述。

203、因此，在一个优选的实施例中，药物组合物可以进一步包含可以被翻译成mcidas的功能性版本的mrna。

204、本公开还涉及编码如seq id no:1或5至11中任一项所示的人ccdc40的多核糖核苷酸。

205、在本公开的任何前述或其他方面和实施例的一些实施例中，所述多核糖核苷酸或修饰的多核糖核苷酸编码人ccdc40(例如，功能性人ccdc40)，并且包含与seq id no:1或5至11中的一个或多个(例如，与seq id no:1或5至11所述的序列)至少85％、至少90％、至少92％或至少95％相同(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)的一级序列。

206、在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含t7启动子的一部分、ethris的最小5'非翻译区(utr)、cyba5'utr、kozak元件，随后是编码人ccdc40蛋白的功能性版本的密码子优化序列、cyba 3'utr和聚(a)尾(参见例如seq id no:1)。

207、在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含t7启动子的一部分、ethris的最小5'非翻译区(utr)、kozak元件、随后是编码人ccdc40蛋白的功能性版本的密码子优化序列、和聚(a)尾(参见例如seq id no:5)。

208、在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含t7启动子的一部分、ethris的最小5'非翻译区(utr)、额外的u核苷酸、tisu元件，随后是编码人ccdc40蛋白的功能性版本的密码子优化序列，和聚(a)尾(参见例如seq id no:6)。

209、在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含t7启动子的一部分、ethris的最小5'非翻译区(utr)、hag 5'utr、kozak元件，随后是编码人ccdc40蛋白的功能性版本的密码子优化序列，和聚(a)尾(参见例如seq id no:7)。

210、在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含t7启动子的一部分、ethris的最小5'非翻译区(utr)、人cmv ie9 5'utr、kozak元件，随后是编码人ccdc40蛋白的功能性版本的密码子优化序列、人生长激素3'utr和聚(a)尾(参见例如seq id no:8)。

211、在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含t7启动子的一部分、ethris的最小5'非翻译区(utr)、kozak元件、egfp编码序列、g4s间隔区，随后是编码人ccdc40蛋白的功能性版本的密码子优化序列，以及聚(a)尾(参见例如seq id no:9)。

212、在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含t7启动子的一部分、ethris的最小5'非翻译区(utr)、kozak元件、随后是编码人ccdc40蛋白的功能性版本的密码子优化序列、g4s间隔区、egfp编码序列和聚(a)尾(参见例如seq id no:10)。

213、在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含t7启动子的一部分、ethris的最小5'非翻译区(utr)、cyba 5'utr、kozak元件，随后是ha标签、g4s间隔区、编码人ccdc40蛋白的功能性版本的密码子优化序列、t2a肽、编码tdtomato的序列、cyba 3'utr和聚(a)尾(参见例如seq id no:11)。

214、在一些实施例中，所述多核糖核苷酸是修饰的多核糖核苷酸，其具有选自本文所述的任何此类水平和/或类型的修饰水平和/或类型。

215、在某些实施例中，多核糖核苷酸的同一性百分比仅相对于seq id no:1或5至11的ccdc40编码序列-部分来测量(例如，当计算同一性百分比时，不考虑utr、其他非编码序列和gfp或表位标签，并且多核糖核苷酸可以包含或可以不包含这样的区域)。

216、在任何前述的某些实施例中，这种多核糖核苷酸(或修饰的多核糖核苷酸)编码功能性ccdc40蛋白。

217、本公开还涉及编码如seq id no:2或12至14中任一项所示的人ccdc39的多核糖核苷酸。

218、在本公开的任何前述或其他方面和实施例的一些实施例中，所述多核糖核苷酸或修饰的多核糖核苷酸编码人ccdc39，并且包含与seq id no:2或12至14中的一个或多个(例如，与seq id no:2或12至14所示的序列)至少85％、至少90％、至少92％或至少95％相同(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)的一级序列。

219、在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含t7启动子的一部分、ethris的最小5'utr、cyba 5'utr、kozak元件，随后是编码人ccdc39蛋白的功能性版本的密码子优化序列、cyba 3'utr和聚(a)尾(参见例如seq id no:2)。

220、在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含t7启动子的一部分、ethris的最小5'utr、kozak元件，随后是编码人ccdc39蛋白的功能性版本的密码子优化序列、和聚(a)尾(参见例如seq id no:12)。

221、在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含t7启动子的一部分、ethris的最小5'utr、附加的u核苷酸、tisu元件，随后是编码人ccdc39蛋白的功能性版本的密码子优化序列和聚(a)尾(参见例如seq id no:13)。

222、在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含t7启动子的一部分、ethris的最小5'utr、作为5'utr的sp30(即30个核苷酸的随机序列)、kozak元件，随后是编码人ccdc39蛋白的功能性版本的密码子优化序列，和聚(a)尾(参见例如seq id no:14)。

223、在一些实施例中，多核糖核苷酸是修饰的多核糖核苷酸，其具有选自本文所述的任何此类水平和/或类型的修饰水平和/或类型。

224、在某些实施例中，多核糖核苷酸的同一性百分比仅相对于seq id no:2或12至14的ccdc39编码序列-部分来测量(例如，当计算同一性百分比时，不考虑utr、其他非编码序列和gfp或表位标签，并且多核糖核苷酸可以包含或可以不包含这样的区域)。

225、在任何前述的某些实施例中，这种多核糖核苷酸(或修饰的多核糖核苷酸)编码功能性ccdc39蛋白。

226、本公开还涉及编码如seq id no:4所示的人mcidas的多核糖核苷酸。在本公开的任何前述或其他方面和实施例的一些实施例中，多核糖核苷酸或修饰的多核糖核苷酸编码人mcidas，并且包含与seq id no:4(例如，与seq id no:4所示的序列)至少85％、至少90％、至少92％或至少95％相同(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同)的一级序列。在某些实施例中，所述多核糖核苷酸在其5'端包含t7启动子的一部分，ethris的最小5'utr、kozak元件，随后是编码人mcidas蛋白的功能性版本的密码子优化序列，任选的3'utr(其也用作基于pcr的模板生产的反向引物结合位点)，以及聚(a)尾。在一些实施例中，多核糖核苷酸是修饰的多核糖核苷酸，其具有选自本文所述的任何此类水平和/或类型的修饰水平和/或类型。在某些实施例中，多核糖核苷酸的同一性百分比仅相对于seq id no:4的mcidas编码序列-部分来测量(例如，当计算同一性百分比时，不考虑utr、其他非编码序列和gfp或表位标签，并且多核糖核苷酸可以包含或可以不包含这样的区域)。在任何前述的某些实施例中，这种多核糖核苷酸(或修饰的多核糖核苷酸)编码功能性mcidas蛋白。

227、为了确定第一序列相对于第二序列的同一性百分比，使类似物(例如，甲基胞苷)与胞苷等匹配等。在某些实施例中，术语“一级序列”可以用于指多核苷酸序列，而不考虑是否修饰或修饰水平，使得与cucucua相同的一级序列将包括该序列，而不管所述核苷酸中的任何一个或全部是否被修饰(例如，c、u和a中的任何更多个或更多个的类似物可能存在并且将被认为是相同的一级序列)。

228、在某些实施例中，同一性百分比仅通过参考给定所列序列中与例如ccdc40或ccdc39的编码序列相对应的部分来确定。而在其他实施例中，通过参考编码序列和一个或多个非编码序列来确定同一性百分比。在某些实施例中，在所列序列的整个长度上确定同一性百分比(例如，通过参考本文序列表中列出的序列的整个长度)。

229、此外，本发明涉及一种用于分析多核糖核苷酸对纤毛形成的作用的方法，其中所述多核糖核苷酸编码参与纤毛形成和/或纤毛形成所需的蛋白，所述方法包括以下步骤：

230、(a)获得患有纤毛疾病的受试者的鼻刷，所述鼻刷包含未分化的基底细胞和分化的纤毛细胞，

231、(b)培养从步骤(a)获得的细胞作为用于获得未分化的基底细胞和去分化的纤毛细胞的浸没(submerse)细胞培养物，

232、(c)培养从步骤(b)获得的未分化的基底细胞和去分化的纤毛细胞作为气液界面细胞培养物并进行气升，

233、(d)用编码参与纤毛形成和/或纤毛形成所需的蛋白的多核糖核苷酸转染从步骤(c)获得的细胞，

234、(e)培养从步骤(d)获得的转染细胞以用于获得分化的纤毛细胞，以及

235、(f)使用乳酸脱氢酶测量、nucgreen测定、高速视频显微镜检查、纤毛搏动频率测量、粘液纤毛清除率测定和/或免疫荧光染色来确定所述多核糖核苷酸对纤毛形成的作用。

236、为了获得患者的呼吸上皮的细胞，鼻刷是有利的，因为其易于操作并且程序对于患者来说是快速且无痛的。从鼻刷获得的细胞包括可以培养为浸没细胞培养物的未分化的基底细胞和分化的纤毛细胞。通过将细胞培养为浸没细胞培养物，可以获得未分化的基底细胞和去分化的纤毛细胞，因为浸没条件诱导上皮细胞的去分化。然后，将如此获得的去分化的纤毛细胞以及鼻刷的未分化的基底细胞培养为气液界面(ali)细胞培养物。

237、步骤(c)的气液界面细胞培养物是指这样的细胞培养物，其特征在于细胞的基面与液体培养基接触，而顶面则暴露于空气。可以将细胞接种到例如细胞培养插入物的可渗透膜上，细胞培养插入物最初向顶隔室(apical compartment)和底隔室(basalcompartment)提供培养基。这也可以被称为“浸没细胞培养物”。一旦达到汇合，则使细胞经历“气升”步骤，其中培养基只供应到底隔室(basal chamber)上。这模拟了在例如呼吸系统中发现的条件，并且在未分化的纤毛细胞中诱导细胞分化，包括纤毛形成。因此，可以获得模拟呼吸系统的上皮的细胞，包括例如基底细胞和纤毛细胞，用于体外的进一步研究。

238、然后，可以用编码参与纤毛形成和/或纤毛形成所需的蛋白的多核糖核苷酸转染所获得的上皮模拟细胞。因此，将所述多核糖核苷酸引入到细胞中，这可以通过病毒感染或除了病毒感染以外的手段人工进行，以在细胞中表达外源性多核糖核苷酸。然后，培养转染的细胞，以用于从基底和未分化的纤毛细胞获得分化的纤毛细胞。因此，多核糖核苷酸(如mrna)对纤毛形成的作用可以在体外确定，同时保留模拟呼吸系统的上皮的细胞环境，如在例如受试者中可以发现的。

239、多核糖核苷酸对纤毛形成的作用可以通过本领域技术人员已知的各种方法来确定。这些方法包括例如乳酸脱氢酶测量、nucgreen测定、高速视频显微镜检查、纤毛搏动频率测量、粘液纤毛清除率测定和/或免疫荧光染色。因此，可以进行乳酸脱氢酶测量(ldh)，以确定在细胞周围的环境中释放的ldh的量。相应的测定可以是比色测定，其中释放的ldh的量用酶促反应测量，该酶促反应将例如碘硝基四唑鎓(iodonitrotetrazolium)或四唑鎓盐转化为红色甲臜。因此，可以通过光谱学容易地读取测定。

240、可替代地或另外地，可以进行nucgreen测定。nucgreen是一种与核酸结合后的永久性绿色荧光核酸染色，并且可以用于研究例如转染的毒性相关效应。可替代地或另外地，可以对由转染的多核糖核苷酸编码的蛋白进行免疫荧光染色，以确定其量和细胞定位，包括与其他蛋白的共定位。为了确定表达的蛋白的量，也可以使用蛋白印迹技术。

241、此外，纤毛结构缺陷或纤毛的缺乏可以例如使用专业显微镜检查来检测。筛选试验包括例如鼻一氧化氮生成率的测量、通过对鼻细胞进行高速视频显微镜检查纤毛运动、或进行包括糖精试验的体内试验。更具体的诊断需要例如通过免疫荧光和透射电镜检查纤毛。

242、可替代地或另外地，可以应用纤毛搏动频率测量，以使用高速视频显微镜检查来研究搏动频率、搏动纤毛和纤毛细胞的数量以及搏动同步性。这同样适用于粘液纤毛清除率测定，可以进行该测定以确定受纤毛功能影响的粘液清除率。

243、关于在所述方法中待使用的多核糖核苷酸，与上文结合用于治疗纤毛疾病的本发明的药物组合物所述相同。此外，这种多核糖核苷酸的其他特征也可以如上所述。

244、此外，多核糖核苷酸可能含有编码标志物的序列。示例包括如在所附实例以及相应的检测方法中所述的tdtomato(如例如在seq id no:3中包含的)、绿色荧光蛋白(gfp)和增强型gfp(egfp)。这对于验证用多核糖核苷酸成功转染细胞尤其有利。

245、在用于分析多核糖核苷酸对纤毛形成的作用的方法的一些实施例中，在步骤(c)中进行气升后0至12天内，优选地0至11天内，更优选地0至6天内，甚至更优选地0至4天内，并且最优选地0至48小时内转染细胞。这是有利的，因为气升步骤诱导基底和未分化的纤毛细胞的纤毛形成。

246、在用于分析多核糖核苷酸对纤毛形成的作用的方法的一些实施例中，使用具有式(v)、(vi)和/或(vii)所示的结构的类脂质，用编码参与纤毛形成和/或纤毛形成所需的蛋白的多核糖核苷酸(优选地mrna)转染细胞。

247、在用于分析多核糖核苷酸对纤毛形成的作用的方法的一些实施例中，在步骤(b)至(e)中使用培养基g培养细胞。培养基g的组成通常如表2所示)。

248、表2

249、 物质 体积 最终浓度 dmem/ham's f12 100ml ultroser g 2ml 2％ 胎儿克隆ii 2ml 2％ 胰岛素 100μl 2.5μg/ml 牛脑提取物 250μl 22.5μg/ml 转铁蛋白 100μl 2.5μg/ml 氢化可的松 20μl 20nm 3,3',5-三碘-l-甲状腺氨酸 3.33μl 500nm 肾上腺素 10μl 1.5μm 视黄酸 10μl 10nm 磷酸乙醇胺 5μl 250nm 乙醇胺 100μl 250nm dapt 10μl 1μm

250、在用于分析多核糖核苷酸对纤毛形成的作用的方法的一些实施例中，在步骤(b)至(e)中使用表3所示的培养基之一来培养细胞。表3所示的培养基是市场上一些可以用于使ali培养物生长的市售培养基。

251、表3

252、 供应商 生长阶段 分化阶段 lonza ali-g ali-d stemcell ali-ex ali-m epithelix mucilair mucilair pelobiotech pelo pelo

253、在用于分析多核糖核苷酸对纤毛形成的作用的方法的一些实施例中，鼻刷进一步包含成纤维细胞，并且其中所述成纤维细胞的生长在步骤(b)至(e)中被抑制。这是有利的，因为与基底和未分化的纤毛细胞相比，成纤维细胞生长得更快，并且因此可以妨碍如上所述的多核糖核苷酸对纤毛形成的作用的研究。

254、在将细胞转移到固定相的烧瓶中之前，由于1-2小时的短孵育时间，成纤维细胞可以与其余细胞分离。在该时间期间，成纤维细胞可以沉降(settledown)并粘附在细胞烧瓶上。所有其他细胞作为悬浮细胞保留在培养基中，并且之后可以很容易地被转移到“固定相烧瓶”中。

255、根据本发明的方法优选地导致多核糖核苷酸的鉴定，所述多核糖核苷酸对纤毛形成具有积极作用并且可以用于恢复纤毛细胞结构的功能，并且因此，导致根据第二方面的药物组合物以及其在治疗患有根据本发明第一方面的纤毛疾病的受试者的纤毛疾病中的用途。因此，关于多核糖核苷酸的特征，与上文结合本发明用于治疗纤毛疾病的药物组合物所述相同。此外，这种多核糖核苷酸的其他特征也可以如上所述。