形态可塑的仿生矿化复合骨填充材料及其制备方法与应用与流程

本发明属于骨填充材料的制备，具体涉及一种形态可塑的仿生矿化复合骨填充材料及其制备方法与应用。

背景技术：

1、种植牙术中，牙齿拔除后，牙槽嵴呈进行性、不可逆性吸收，常造成骨量减少、牙槽嵴低平等问题，给义齿修复或种植体植入造成困难，同时严重影响患者的美观。大量临床研究表明使用骨填充材料进行拔牙位点保存，能够有效减少牙槽嵴的吸收，为后期种植修复提供足够的骨量和良好的骨质，这也是目前最常用的治疗方法。从材料角度，其产品主要分为四类：①天然生物衍生材料，如脱钙骨基质(同种异体骨、异种骨)、壳聚糖、藻酸盐等；②人工合成无机材料，如羟基磷灰石(ha)、磷酸三钙(tcp)、生物活性玻璃；③人工合成有机材料，如聚乳酸及其共聚物；④人工合成复合材料，如胶原蛋白-tcp等有机-无机复合物等。

2、一般来说，理想的骨填充材料需要同时具备：①骨传导性，即“土壤”的支架作用，有利于毛细血管和骨细胞长入材料中；②骨诱导性，即“养料”的营养作用，能促进间充质细胞分化为成骨细胞。虽然脱钙骨基质已经被广泛证明兼具明确骨诱导和骨传导作用，但实际临床使用时仍比较困难：①一方面，脱钙骨基质颗粒较松散，即无法精准填充于窄小的拔牙窝内，又无法稳定停留于拔牙窝处，易被血液或冲洗操作冲刷掉；②如果提前预成型，样品过大时无法植入拔牙窝内，样品过小时造成的死腔会造成牙槽骨缺损；③缺乏骨形成所需钙、磷，成骨速度较慢。

3、一些研究开始关注如何通过较为温和的方式处理松质骨，使其既无免疫原性又能保留骨诱导性，并可原位矿化与人体骨骼结构组分较为一致的羟基磷灰石涂层，使骨填充材料的降解及钙磷释放变得可控。现有产品将骨形态发生蛋白-2与羟基磷灰石等材料复合而成，但价格高昂，且其释放速度较难实现可控，易引起过度修复或修复不全的风险。

4、例如，中国专利文献cn116712613a提供了一种骨填充材料，由原料a(透明质酸或者壳聚糖)与原料a之间通过交联剂交联，胶原蛋白与胶原蛋白之间共价交联；羟基磷灰石以物理沉积的方式沉积在胶原蛋白上制备得到骨填充材料的方式。具有与天然骨膜一致的物质组成和微观及宏观结构，并具备良好的力学性能和生物降解特性。但由于是单纯物理混合，无法做到无机相与有机相的均匀分布。

5、中国专利文献cn105169482a提供一种牙科骨替代材料，其是采用化学处理及煅烧工艺制备胎牛松质骨多孔支架，表面处理形成磷酸钙矿化结晶。较其他种类动物来源的骨替代材料具有更短的体内代谢时间，更符合临床植骨的需要。但由于以煅烧骨作为载体，缺乏天然骨组织的有机成分，无骨诱导性。

6、中国专利文献cn1106861c提供了一种纳米相钙磷盐/胶原/聚乳酸骨复合多孔材料，涉及一种原位矿化胶原的方法，其成分与人骨相近。但其载体为提纯胶原，无骨诱导性，并且难以随意调控矿化程度。

7、中国专利文献cn109276761b提供了一含rh-bmp2和磷酸盐的骨修复材料，是以壳聚糖为缓释载体，实现了bmp-2持续有效的工作浓度。但缺乏骨组织胶原支架结构，无法再现原位仿生矿化，无机成分释放速度不可控。

8、另外，中国专利文献cn 109381745 b提供了一种胶原珊瑚羟基磷灰石复合骨填充支架材料，不但可以有效的避免天然组织提取中的疾病传播的风险，又具有人工合成羟基磷灰石所不具备的天然孔洞结构，解决了珊瑚羟基磷灰石颗粒本身不好塑形的缺点。但该骨填充支架材料缺乏天然骨组织的有机成分，无骨诱导性，并且其预先塑形难以适应复杂的骨缺损创面。

9、中国专利文献cn 114366854 b提供了一种复合脱钙骨基质的硅胶隆鼻材料，但该材料缺乏天然骨组织的无机成分，仅靠硅胶起支撑作用，无新骨形成作用。

10、因此，一方面如何解决现有骨填充材料缺乏骨诱导性，实现骨填充材料保留充足的活性物质，具有高效的骨诱导性；另一方面还能实现更好的矿化效果，实现骨缺损部位的更快速修复；同时还要解决常见脱钙松质骨产品缺乏骨形成所需的钙、磷，骨填充材料的塑形性差，手术操作难度大等问题，成为亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明就是为了解决上述技术问题，从而提供一种形态可塑的仿生矿化复合骨填充材料及其制备方法与应用。本发明的技术目的在于，提供一种脱钙效率高、活性成分含量高、可原位矿化、且矿化效果好、同时具备形态可塑、可注射性、方便操作的骨填充材料，以解决现有的骨填充材料存在的活性成分含量低、缺乏骨诱导性、矿化效果不佳、以及塑形性差、操作难度大等问题。

2、为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明首先提供了一种形态可塑的仿生矿化复合骨填充材料的制备方法，包括以下步骤：

4、(一)脱钙松质骨的制备

5、(1)将松质骨粉碎成粒径为0.3～0.8mm的骨粉，然后按照料液比1：5～1：30w/v加入到edta溶液中，室温振荡脱钙4～16小时；

6、(2)将步骤(1)处理后的松质骨按照料液比1：4w/v加入到过氧乙酸溶液中，室温振荡2小时；

7、(3)将步骤(2)处理后的松质骨按照料液比1：5～1：10w/v加入到异丙醇中，室温振荡脱脂24小时；

8、(4)将步骤(3)处理后的松质骨按照料液比1：5～1：10w/v加入到1～4wt％脱氧胆酸钠溶液中，室温振荡脱细胞8～24小时，制备得到脱钙松质骨；

9、(二)矿化脱钙松质骨的制备

10、(5)将步骤(4)所得脱钙松质骨按照料液比1：5～1：10w/v加入到2～3wt％的三偏磷酸钠溶液中，室温振荡1小时，进行磷酸化处理；

11、(6)将磷酸化处理后的脱钙松质骨按照料液比1：200～1：500w/v浸入到矿化液中，于37℃振荡仿生矿化1-5天，所述矿化液的组成为：氯化钠100-160mm、磷酸氢二钾2-4mm，氯化镁3-5mm，4羟乙基哌嗪乙磺酸35-40mm，碳酸氢钠15-22mm，氯化钙6-9mm，ph值为6.5-7.0，制备得到矿化脱钙松质骨；

12、(三)温敏性松质骨水凝胶的制备

13、(7)取步骤(4)所得脱钙松质骨，按照料液比1：100w/v加入到0.1wt％猪胃蛋白酶溶液中，于4℃搅拌处理24～48小时；

14、(8)向步骤(7)处理所得物中加入碱调节ph至7.2～7.4，然后向其中加入pbs缓冲液将溶液离子强度调节至0.5～1.5×pbs，随后再加入1×pbs，将水凝胶溶液的浓度调至0.4～0.8wt％；

15、(四)仿生矿化复合骨填充材料的制备

16、(9)取步骤(6)所得矿化脱钙松质骨，按照料液比1～3：1w/v加入至步骤(8)所得水凝胶溶液中，于4℃搅拌24小时，即得仿生矿化复合骨填充材料。

17、本发明提供的上述制备方法，首先通过仿生矿化技术，制备出与自体骨具有相似结构、成分及微观形貌的矿化脱钙松质骨材料。该材料通过磷酸化处理，增加了脱钙松质骨的成核位点，一方面缩短了矿化总时长，另一方面使得矿化过程更加稳定。模拟自然骨矿化，在脱钙松质骨上原位矿化形成无机盐涂层，具有更好地促进新骨的形成作用和引导骨再生的作用。通过本发明的磷酸化及矿化处理，很好解决了现有骨填充材料通常活性成分含量低、降解周期长的问题。该方法首次在天然脱钙松质骨支架上矿化形成了纳米级羟基磷灰石，去除了免疫原性，很好保留活性成分，并且可调控细胞信号传导，使之可被机体自调节释放钙磷并高效成骨。

18、本发明方法制备的骨填充材料通过对动物股骨取松质骨、前处理、脱钙、病毒灭活、脱脂、脱细胞、仿生矿化获得，以天然骨骼多孔三维立体的胶原蛋白支架为基础，矿化为有纳米级羟基磷灰石为主要成分的材料，很好保留了骨诱导性。不仅能为再生的组织细胞提供三维支架结构，还具有调控再生细胞行为(包括细胞形态、黏附、增殖、迁移、分化及凋亡)等作用，具备良好的生物相容性和生物降解性能。此外，其制备工艺流程简单、成本低、时间短，并且可调控终产品矿化程度。

19、在此基础上，本发明通过进一步将上述矿化脱钙松质骨与温敏性松质骨水凝胶进行复合，制备出一种形态可塑的仿生矿化复合骨填充材料，该复合材料以脱钙松质骨为载体，在矿化液中发生原位矿化得到骨填充材料，同时将该骨填充材料与脱钙松质骨来源的温敏性水凝胶充分混匀，形成复合骨填充材料，使其具备形态可塑和可注射性，其操作方法简单。该方法解决了常见脱钙松质骨产品缺乏骨形成所需的钙、磷，以及塑形性差、手术操作难度大等问题。

20、本发明经原位矿化后的脱钙松质骨具有天然骨的孔隙结构和纳米级羟基磷灰石，同时可生物降解、具有生物相容性及骨诱导性，更有利于血管和细胞的生长增殖，在临床上实现修复速度更快的优势。

21、本发明创造性地采用具有天然骨骼多孔三维立体的胶原蛋白支架为有机成分，且维持了松质骨天然孔隙率，其孔洞大小适合骨组织及血管组织长入。因此不仅能为再生的组织细胞提供三维支架结构，还含有丰富的非胶原蛋白类其他信号大分子及骨诱导蛋白成分，使得该骨填充材料具有优秀的成骨性能。表面纳米级的羟基磷灰石涂层随人体自调节释放钙磷及活性物质，诱导缺损部位成骨后，裸露的胶原蛋白支架可较为快速的降解并为成骨部位提供所需物质。因此该骨填充材料还具备优异的可根据人体所需调节的降解性能。

22、进一步的是，步骤(1)中所述edta溶液的浓度为10wt％；作为优选的方案，所述edta溶液的ph值为7.4。

23、进一步的是，步骤(2)中所述过氧乙酸溶液的浓度为0.3wt％。

24、进一步的是，步骤(4)中所述脱氧胆酸钠溶液的ph为8。

25、进一步的是，步骤(5)中所述三偏磷酸钠溶液的ph为10。

26、进一步的是，步骤(6)中在振荡仿生矿化过程中，每24小时更换一次矿化液。

27、进一步的是，步骤(1)至步骤(6)中，均对每步处理后的松质骨进行清洗，所述清洗的步骤为：将处理后的松质骨以料液比1：10～1：20w/v倒入纯化水中，室温振荡清洗1小时，每5分钟换液一次。

28、进一步的是，步骤(7)中所述猪胃蛋白酶溶液的ph为2～3。

29、进一步的是，步骤(8)中所述调节ph和离子强度的操作为：向步骤(7)处理所得物中于4℃搅拌状态下逐滴加入0.1m氢氧化钠，直至ph范围7.2～7.4，然后向所得物中缓慢加入10×pbs缓冲液，将溶液离子强度调节至0.5～1.5×pbs。

30、本发明的有益效果如下：

31、(1)本发明方法制备获得的复合骨填充材料中有机相的比例为15％-25wt％，无机相的组成为35％-55wt％(其余组分为水)，其与天然骨组成和结构相似；

32、(2)本发明制备的复合骨填充材料含有丰富的骨形态发生蛋白bmp-2等成骨相关活性因子，具有优良的骨诱导性；

33、(3)本发明的复合骨填充材料去除了免疫原性，很好保留了活性成分，并且可调控细胞信号传导，使之可被机体自调节释放钙磷并高效成骨；

34、(4)本发明的复合骨填充材料具备优良的可塑形性和可注射性；

35、(5)本发明的复合骨填充材料可用于口腔颌面部骨缺损的快速修复，并且可在3个月内完成生物降解，与骨形成时间协调一致。