一种提高可悬浮培养海茴香胚性愈伤组织诱导率的方法与流程

本发明涉及一种提高可悬浮培养海茴香胚性愈伤组织诱导率的方法，属于工业生物。

背景技术：

1、海茴香( crithmum maritimum)来源于伞形科( apiaceae)，为欧洲可食用的嗜盐植物。海茴香生在欧洲的海洋盐渍地区，可以在地中海和大西洋沿岸的岩石或沙丘上找到，是一种耐盐植物，耐盐植物及微生物经常作为天然活性分子库，作为药物开发的。海茴香在营养贫瘠，遭受海水侵蚀的礁石上仍能顽强生长，因为其中含有大量自我保护的生物活性物质，这些物质包含了丰富的氨基酸、脂质、蛋白质、维生素，还有生物活性肽。这些活性物消除了高盐度引起的高自由基含量，同时具有抗菌、抗炎、免疫的特性，保证了海茴香能够在营养贫瘠且盐度极高的环境中存活。

2、现有的海茴香胚性愈伤组织诱导主要是通过种子萌发后的苗，植株的茎段、叶片及根部等的一部分作为外植体进行胚性愈伤组织的诱导，但是种子萌发这一阶段则至少需要三个月的时间，大大拉长了建立液体悬浮培养体系的时间。而且，现有的胚性愈伤组织的诱导率也比较低，诱导出来的细胞可悬浮性培养的性能较差。

3、鉴于此，本申请提供一种提高可悬浮培养海茴香胚性愈伤组织诱导率的方法，以弥补上述不足。

技术实现思路

1、本发明提供一种提高可悬浮培养海茴香胚性愈伤组织诱导率的方法。本发明通过对外植体的筛选最终确定采用茎段作为愈伤组织的诱导体，不经过萌发直接诱导海茴香胚性愈伤组织，实现可悬浮培养胚性愈伤组织的诱导率为 75%-94.2%，最高达到90%，与现有技术的最高诱导率76%相比，最高提升了18.2%，能够缩短诱导时间，并为大规模培养海茴香细胞提供了状态良好的愈伤组织。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种提高可悬浮培养海茴香胚性愈伤组织诱导率的方法，包括如下步骤：

3、将海茴香消毒后，切段，接入ph值为5-6的诱导培养基中，在温度为20-30℃光照培养15-30天，即得到海茴香胚性愈伤组织，其中，所述诱导培养基由ms基础盐培养基、蔗糖25-35g/l、琼脂8-9g/l、2,4-d 0.3-0.5mg/l、naa 0.3-0.6mg/l和kt 1-2mg/l组成的营养水溶液。

4、本发明的原理是：海茴香的任何外植体部分都可以诱导生成愈伤组织，但可实现悬浮培养的胚性愈伤组织的效率明显不同。本发明采用海茴香的茎段作为外植体直接制作愈伤组织，通过优化诱导培养条件，得到的胚性愈伤组织细胞的形成率高、细胞的可悬浮培养性强。

5、本发明的诱导培养基，由ms基础盐培养基、蔗糖、琼脂、2,4-d、naa和kt组成。其中，ms基础盐培养基提供植物细胞生长的基本营养元素，为细胞生长提供必须的无机盐及微量元素营养；蔗糖提供植物细胞生长的碳源；琼脂用作固凝剂，以便于愈伤组织细胞能够进行表层生长繁殖；2,4-d用作生长素；naa用作生长激素；并有助于其胚性愈伤组织松散型的形成，更适合于悬浮培养；kt用作激动素，具有延缓离体叶片衰老，诱导芽分化和增加气孔开度的作用。本发明的诱导培养基能够促进海茴香胚性可悬浮培养愈伤组织细胞生成，能够快速高效得到松散型的胚性愈伤组织细胞，用于悬浮液态培养。

6、在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

7、进一步，所述诱导培养基由ms基础盐培养基、蔗糖30g/l、琼脂9g/l、2,4-d 0.5mg/l、naa 0.3mg/l和kt 1mg/l组成。

8、采用上述进一步的有益效果是：所述诱导培养基采用上述组成，更加有利于诱导海茴香外植体形成胚性愈伤组织细胞。

9、进一步，所述ms基础盐培养基水溶液组分由kno31900mg/l、nh4no31650mg/l、mgso4·7h2o 370mg/l、kh2po4170mg/l、cacl2·2h2o 440mg/l、mnso4·4h2o 22.3mg/l、znso4·7h2o 8.6mg/l、h3bo36.2mg/l、ki 0.83mg/l、na2moo4·2h2o 0.25mg/l、cuso4·5h2o0.025mg/l、cocl2·6h2o 0.025mg/l、na2-edta 37.3mg/l、feso4·7h2o 27.8mg/l、甘氨酸2.0mg/l、盐酸吡哆醇0.6mg/l和盐酸硫铵素0.1mg/l组成。

10、进一步，所述诱导培养基的ph值为5.85。

11、进一步，所述温度为25℃，所述诱导培养的时间为18天。

12、名词解释：

13、2,4-d，即二氯苯氧乙酸，具有代表性的合成植物生长素.

14、naa，即萘乙酸，是一种生长素类似物，作用与植物生长素相似萘乙酸。

15、kt，即激动素，是一种非天然的细胞分裂素。

16、本发明的有益效果是：本发明通过对外植体的筛选最终确定采用茎段作为愈伤组织的诱导体，不经过萌发直接诱导海茴香胚性愈伤组织，实现可悬浮培养胚性愈伤组织的诱导率为 75%-94.2%，最高达到90%，与现有技术的最高诱导率76%相比，最高提升了18.2%，能够缩短诱导时间，并为大规模培养海茴香细胞提供了状态良好的愈伤组织。

17、本发明开发了促进海茴香胚性可悬浮培养愈伤组织细胞生成的诱导培养基，能够快速高效得到松散型的胚性愈伤组织细胞，用于悬浮液态培养。

18、本发明的方法简单，市场前景广阔，适合工业化生产。

技术特征：

1.一种提高可悬浮培养海茴香胚性愈伤组织诱导率的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的扩繁方法，其特征在于，所述步骤1）消毒的方法包括以下步骤：将所述海茴香冲洗后依次经乙醇溶液消毒和次氯酸钠溶液消毒。

3.根据权利要求2所述的扩繁方法，其特征在于，所述乙醇溶液的体积百分含量为75%，消毒时间为30s；所述次氯酸钠溶液的质量百分含量为4-8%，消毒时间为15min。

4.根据权利要求1所述的扩繁方法，其特征在于，所述步骤2）消毒外植体为幼嫩茎段，切成长度约为1-2cm的茎段再进行愈伤组织诱导培养。

5.根据权利要求1所述的扩繁方法，其特征在于，所述步骤2）愈伤组织培养基为ms基础盐培养基、蔗糖25-35g/l、琼脂8-9g/l、二氯苯氧乙酸 0.3-0.5mg/l、萘乙酸 0.3-0.6mg/l、激动素 1-2mg/l，所述培养基ph为5.8-6.0。

6.根据权利要求1或5所述的扩繁方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导的条件包括：在温度为25℃、光照和相对湿度为65%下培养20天。

7.根据权利要求1或5所述的扩繁方法，其特征在于，所述培养方法用于培养海茴香胚性愈伤组织。

技术总结本发明公开了一种提高可悬浮培养海茴香胚性愈伤组织诱导率的方法，属于工业生物技术领域。其包括如下步骤：将海茴香消毒后，切段，接入pH值为5‑6的诱导培养基中，在温度为20‑30℃光照培养15‑30天，即得到海茴香胚性愈伤组织，其中，所述诱导培养基由MS基础盐培养基、蔗糖25‑35g/L、琼脂8‑9g/L、2,4‑D 0.3‑0.5mg/L、NAA 0.3‑0.6mg/L和KT 1‑2mg/L组成。本发明实现可悬浮培养胚性愈伤组织的诱导率为75%‑94.2%，能够缩短诱导时间，并为大规模培养海茴香细胞提供了状态良好的愈伤组织。技术研发人员：王泽建,任睿,寥雨茜,梁琦,任志红,张悦受保护的技术使用者：上海晟域美科生物技术有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/18