一种Plexin-D1抗体检测试剂盒及其在神经系统疼痛疾病中的应用的制作方法

本发明属于基因检测，具体是指一种plexin-d1抗体检测试剂盒及其在神经系统疼痛疾病中的应用。

背景技术：

1、神经系统自身免疫性疾病是免疫分子或细胞攻击神经系统引起的疾病，具有广泛的临床表现，包括感觉运动异常、认知意识障碍、行为或精神异常、神经性疼痛（nep）等。其中，神经性疼痛与自身抗体之间的相互作用有很大关系，由体感通路中抗原的特异性自身抗体引起的igg介导的疼痛障碍是引发神经系统自身免疫性疾病神经性疼痛的主要原因之一；采用小鼠组织的间接免疫荧光测试筛选了与体感通路中疼痛传导背根神经节（drg）和脊髓背角特异性结合的血清自体抗体，结果在患有nep的样本中发现了针对drg神经元及其神经末梢的特异性igg，通过对患病小鼠igg和drg神经元标志物进行双重免疫染色，并进行蛋白质印迹测定，通过对免疫沉淀物进行分析后，确定了plexin-d1是引起drg的自体抗原，临床表现为免疫炎症（包括神经系统免疫疾病）和过敏性疾病出现的神经疼痛或其他原因不明的神经性疼痛；三叉神经痛。

2、plexin-d1是一种跨膜蛋白，属于plexin家族，这个家族主要参与细胞间的信号传递，plexin-d1在神经发育、免疫反应、心血管系统发育等多个生理过程中起着重要作用，，plexin-d1是semaphorin类分子的受体，尤其是与class 3 semaphorins（如sema3e）结合时，通过调控rho家族gtp酶的活性，参与调节细胞迁移、细胞形态以及细胞骨架的动态变化，plexin-d1是3类和4类信号素的细胞表面受体，在神经系统、胸腺细胞、活化的b细胞、巨噬细胞、树突状细胞和内皮细胞中表达，由于plexin-d1作为跨膜蛋白存在于细胞表面，抗细胞表面自体抗体可以直接接触神经细胞表面分子，通过以下几种机理引起病理性反应：第一、抗体能够影响细胞膜表面上的受体分布或导致其内化，从而使神经元功能异常；第二、抗体能够破坏抗原蛋白之间的相互作用，阻断型号通路，从而引起异常；第三、抗体能够刺激受体发生拮抗作用；第四、抗体能够与抗原形成复合物，生产细胞毒性；第五、抗体能够通过细胞膜的孢吞作用，进入细胞内，引起病理性反应。

技术实现思路

1、针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明采取的技术方案如下：

2、本发明提出一种plexin-d1抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括plexin-d1抗体试剂、免疫荧光a液、免疫荧光b液；

3、优选地，所述免疫荧光a液用于样品稀释，组分包含pbst及豚鼠肝粉；

4、优选地，所述免疫荧光b液包括fitc标记的抗人igg抗体，使用1%bsa稀释。

5、本发明提出了一种plexin-d1抗体检测试剂盒的制备方法，具体包括以下步骤：

6、s1、按照如seqidno:1所示的plexin-d1抗原蛋白的基因序列，pcdna3.1作为载体模板，用限制性内切酶对pcdna3.1载体进行双酶切，pcr扩增并纯化产物，使用t4dna连接酶将酶切好的plexin-d1基因片段与pcdna3.1载体进行连接得到包含plexin-d1基因序列质粒；

7、优选地，在步骤s1中，构建包含plexin-d1基因序列质粒采用的引物序列包括：

8、上游引物：5’-aagcttatgcactcgccgcgccgcgc-3’；

9、下游引物：5’-gaattcaggtttgtccgtaaggc-3’；

10、s2、将步骤s1所述的包含plexin-d1基因序列的质粒加入大肠杆菌c41(de3)感受态细胞中，进行电转化法，加入500µllb培养基，37℃摇床中复苏1小时，将复苏后的细胞涂布在含有氨苄青霉素（ampicillin，50-100µg/ml）的lb琼脂平板上，37℃孵育过夜；

11、s3、使用脂质体转染试剂（lipofectamine2000）将构建好的pcdna3.1-plexin-d1重组质粒转染离体培养的293t细胞中，48h特定条件培养，诱导细胞复制和蛋白表达；

12、优选地，在步骤s3中，293t细胞表单蛋白序列如seq id no:2所示；

13、s4、将经过步骤s3培养293t细胞通过洗涤-固定-洗涤-干燥-穿孔-封闭-湿保存，得到plexin-d1抗体试剂；

14、s5、将步骤s4所制备的plexin-d1抗体试剂、免疫荧光a液和免疫荧光b液组成，得到plexin-d1抗体检测试剂盒。

15、本发明还提供一种plexin-d1抗体检测试剂盒在神经系统疼痛疾病中的应用，所述神经系统自身免疫神经疼痛疾病的症状包括神经性疼痛、三叉神经痛的中的至少一种；

16、优选地，所述plexin-d1抗体检测试剂盒用于区分自身免疫疾病，更进一步地，用于区分神经系统的自身免疫疾病与非自身免疫疾病。

17、本发明取得的有益效果如下：

18、本发明提供了plexin-d1抗体检测试剂盒及其在神经系统疼痛疾病中的应用，plexin-d1是一种细胞膜蛋白，参与神经系统中神经发育和信号传导的调节，plexin-d1在多种神经系统疼痛疾病中的作用逐渐受到关注，通过比较正常和疾病状态下的plexin-d1表达，可以确定其在神经系统疾病中的潜在作用，具有高度灵敏性，能够区分自身免疫疾病与非自身免疫疾病，探究plexin-d1在疼痛疾病中的具体角色，有助于理解疾病机制，推动针对plexin-d1的药物或治疗方法的开发，为疼痛疾病提供新的治疗选择。

技术特征：

1.一种plexin-d1抗体检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括plexin-d1抗体试剂、免疫荧光a液和免疫荧光b液；

2.根据权利要求1所述的一种plexin-d1抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的一种plexin-d1抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：在步骤s1中，构建包含plexin-d1基因序列质粒采用的引物序列包括：

4.根据权利要求3所述的一种plexin-d1抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于：在步骤s3中，293t细胞表单蛋白序列如seq id no:2所示。

5.一种根据权利要求1所述的plexin-d1抗体检测试剂盒在神经系统疼痛疾病中的应用，其特征在于：所述神经系统自身免疫神经疼痛疾病的症状包括神经性疼痛、三叉神经痛的中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的plexin-d1抗体检测试剂盒在神经系统疼痛疾病中的应用，其特征在于：所述plexin-d1抗体检测试剂盒用于区分自身免疫疾病。

7.根据权利要求6所述的plexin-d1抗体检测试剂盒在神经系统疼痛疾病中的应用，其特征在于：用于区分神经系统的自身免疫疾病与非自身免疫疾病。

技术总结本发明公开了基因检测技术领域，具体是指一种Plexin‑D1抗体检测试剂盒及其在神经系统疼痛疾病中的应用，所述试剂盒包括Plexin‑D1抗体试剂、免疫荧光A液和免疫荧光B液。本发明通过比较正常和疾病状态下的Plexin‑D1表达，可以确定其在神经系统疾病中的潜在作用，具有高度灵敏性，能够区分自身免疫疾病与非自身免疫疾病。技术研发人员：麦景文,陈飞雁受保护的技术使用者：阿维森纳（广州）健康科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/18