一种箭叶淫羊藿黄酮醇氧甲基转移酶及其应用

本发明属于植物基因和代谢工程，具体涉及一种来源于箭叶淫羊藿的黄酮醇氧甲基转移酶及其应用。

背景技术：

1、淫羊藿是我国大宗常用中药材，基原为小檗科(berberidaceae)淫羊藿属(epimedium)植物的干燥叶，《中国药典》收录有5种，地方和民间用药有10多种。淫羊藿具有补肾阳、强筋骨、祛风湿、抗衰老、提高免疫功能、保护心脑血管系统、抗炎、抗病毒、止咳平喘、抑制肿瘤等多种功效，是当前医药行业研究和应用的热点。黄酮类成分是淫羊藿中的主要药效成分，当前主要从淫羊藿药材中提取获得，受限于自然资源的逐年减少和人工种植的高成本，生产效率相对较低。微生物细胞工厂通过在微生物中重构植物天然产物的生物合成途径，实现药效成分的高效生产，这种方法具有不依赖野生资源、可操作性高、环境污染少等显著优势，是解决淫羊藿产业限制的关键途径，也是当前淫羊藿药效成分生产的重要研发方向。

2、淫羊藿中的黄酮类药效成分，占较大比例的是以淫羊藿素为骨架的特有黄酮醇类化合物，例如淫羊藿苷、朝藿定a、朝藿定b、朝藿定c、大花淫羊藿苷ii、宝藿苷ii、宝藿苷vii、箭藿苷a和箭藿苷b等。淫羊藿素是淫羊藿属植物的特有成分，也是淫羊藿属植物其他黄酮醇类特有成分的母核骨架，其合成途径与其他植物黄酮醇类化合物唯一的区别是8-异戊烯基山奈酚c-4位置甲基化修饰。氧甲基转移酶负责甲基化8-异戊烯基山奈酚生成淫羊藿素，但目前鲜少有关于淫羊藿黄酮醇氧甲基转移酶的报道。本发明基于对我国分布最为广泛的箭叶淫羊藿开展分子生物学和生物化学研究，公布了一种箭叶淫羊藿黄酮醇氧甲基转移酶及其应用，为淫羊藿药效成分的微生物细胞工厂生产提供了重要的基因元件和相应的技术方法，具有较大的应用前景。

技术实现思路

1、本发明提供了箭叶淫羊藿来源的黄酮醇氧甲基转移酶，包括：

2、(a)由seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

3、(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有黄酮醇氧甲基转移酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

4、本发明还提供了编码所述黄酮醇氧甲基转移酶的基因。在一种实施方式中，所述基因具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。本发明还提供一种表达载体，所述的表达载体携带seq id no.1所示的核苷酸序列。

5、本发明提供一种表达所述黄酮醇氧甲基转移酶的微生物细胞。在一种实施方式中，所述微生物细胞的基因组上整合了seq id no.1所示的基因。在一种实施方式中，所述微生物细胞中含有携带seq id no.1所示基因的重组质粒。在一种实施方式中，所述重组微生物细胞是以大肠杆菌菌株bl21(de3)为宿主，表达seq id no.2所示的黄酮醇氧甲基转移酶或含有携带seq id no.1所示基因的重组质粒。

6、本发明还提供了一种产黄酮醇氧甲基转移酶的方法，是将表达所述黄酮醇氧甲基转移酶的重组大肠杆菌在异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)的诱导下进行蛋白表达。

7、本发明提供一种制备淫羊藿素的方法，以8-异戊烯基山奈酚为底物通过所述的黄酮醇氧甲基转移酶催化实现。

8、本发明挖掘的黄酮醇氧甲基转移酶可以催化8-异戊烯基山奈酚生成淫羊藿素，该反应是中药材淫羊藿中合成淫羊藿素等黄酮醇特有活性成分的关键步骤，因此本发明提供的生物催化方法，可以实现细胞工厂合成淫羊藿素，也是其他淫羊藿特有黄酮醇药效成分细胞工厂生产的关键步骤，具有巨大的应用价值。

技术特征：

1.箭叶淫羊藿来源的黄酮醇氧甲基转移酶，其特征在于，包括：

2.编码权利要求 1 所述黄酮醇氧甲基转移酶的基因。

3.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求 2 所述的基因。

4.表达权利要求 1 所述黄酮醇氧甲基转移酶的微生物细胞。

5.根据权利要求 4 所述的微生物细胞，其特征在于，含有携带 seq id no. 1所示基因的重组质粒，或在基因组上整合了 seq id no. 1 所示的基因。

6.一种体外表达黄酮醇氧甲基转移酶的方法，其特征在于，将表达权利要求 1 所述黄酮醇氧甲基转移酶的重组大肠杆菌在异丙基-β-d-硫代半乳糖苷的诱导下进行蛋白表达。

7.权利要求 1 所述的黄酮醇氧甲基转移酶在催化 8-异戊烯基山奈酚生产淫羊藿素中的应用。

8. 一种生产淫羊藿素的方法，其特征在于，将权利要求 1 所述的黄酮醇氧甲基转移酶添加至含 8-异戊烯基山奈酚的催化体系中，将 8-异戊烯基山奈酚转化为淫羊藿素。

技术总结本发明公开了一种箭叶淫羊藿黄酮醇氧甲基转移酶及其应用。本发明提供的EsOMT26基因是首次在箭叶淫羊藿中克隆的编码黄酮醇氧甲基转移酶基因，全长为1107 bp，编码368个氨基酸。将箭叶淫羊藿黄酮醇氧甲基转移酶基因EsOMT26克隆后构建原核表达系统，其表达蛋白具有黄酮醇氧甲基转移酶活性，催化8‑异戊烯基山奈酚生成淫羊藿素。本发明提供的箭叶淫羊藿黄酮醇氧甲基转移酶及其编码基因为淫羊藿药效成分的微生物细胞工厂生产提供了重要的基因元件和相应的技术方法，具有较大的应用前景。技术研发人员：张燕君,苏威受保护的技术使用者：中国科学院武汉植物园技术研发日：技术公布日：2024/12/2