一种用于风疹病毒全长基因组检测的捕获探针及其试剂盒和应用的制作方法

本发明属于基因组测序，具体涉及一种用于风疹病毒全长基因组检测的捕获探针及其试剂盒和应用。

背景技术：

1、风疹是由风疹病毒引起的以发热出疹等为主要特征的急性呼吸道传染病，然而风疹病毒为致畸性病原，其可以通过胎盘感染胎儿，出现早产/死胎或出生后表现为先天性风疹综合征。根据国际病毒学命名委员会最新分类，风疹病毒为属于马氏病毒科(matonaviridae)风疹病毒属(rubivirus)的单股正链rna病毒，只有一个血清型，但根据世界卫生组织(world health organization，who)定义的靶基因(e1基因的739个核苷酸，e1-739)可划分为13个基因型(1a、1b、1c、1d、1e、1f、1g、1h、1i、1j、2a、2b、2c)。随着1e和2b基因型在全球的广泛流行，利用who推荐的分型方法已无法满足病毒追踪溯源的需求，因此亟需能对风疹病毒全基因组进行高通量测序和分析的方法。

2、目前，探针杂交捕获结合二代测序的检测方法，在肿瘤、遗传病等检测领域已有较广泛的应用，但是，对于病原基因组的检测，仍然是初步阶段。探针杂交捕获凭借其自身适配性强的特性，在病原检测领域有巨大的应用场景。例如新型病毒在得知其与哪类病毒类似的情况下，即可对其基因组进行探针设计和测序实验。探针杂交捕获结合二代测序的检测方法能够极高效率的了解未知病原、极大可能地为预防病毒蔓延提供方式方法等。

3、但是，该方法也有自身的局限性，例如毒株在宿主采集的样本中丰度极低，导致测序无法覆盖该毒株的基因组全长序列。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于风疹病毒全长基因组检测的捕获探针，能够实现对不同风疹病毒毒株实现全长基因组检测。

2、本发明提供了一种用于风疹病毒全长基因组检测的捕获探针，核苷酸序列如seqid no：1～seq id no：796所示。

3、优选的，所述捕获探针上标记有生物素。

4、本发明提供了一种用于风疹病毒全长基因组检测的试剂盒，包括所述捕获探针、链霉亲和素标记的磁珠和文库杂交反应试剂。

5、优选的，所述文库杂交反应试剂包括以下至少一种试剂：targetseqhybbuffer v2、hyb human block、blocking oligo和rnase酶抑制剂。

6、优选的，所述试剂盒还包括rna片段化试剂、反转录反应试剂、cdna二链合成反应试剂、接头连接试剂、纯化试剂、pcr预反应试剂和捕获后pcr扩增反应试剂。

7、优选的，所述pcr预反应试剂包括以下至少一种：含udg酶的pcr master mix和udi引物；

8、所述捕获后pcr扩增反应试剂包括以下至少一种：pcr引物和捕获后pcr反应预混液。

9、本发明提供了所述捕获探针或所述试剂盒在风疹病毒全长基因组检测、风疹病毒基因组变异监测和/或风疹病毒基因组溯源分析中的应用。

10、优选的，所述应用中，利用所述试剂盒获得风疹病毒全长基因组，得到风疹病毒基因组的变异信息，变异信息包括单碱基突变和插入缺失突变；通过将所述变异信息与数据库中基因组序列比对分析，实现风疹病毒基因组变异监测和/或溯源分析的目的；

11、优选的，所述风疹病毒的毒株包括1e型风疹流行株和/或2b型风疹流行株。

12、本发明提供了一种基于所述捕获探针和二代测序检测风疹病毒全长基因组的方法，包括以下步骤：

13、将待测样本的风疹病毒基因组文库与所述捕获探针进行杂交，得到杂交反应液；

14、从所述杂交反应液中分离与探针杂交的dna片段；

15、以所述与探针杂交的dna片段为模板进行捕获后pcr扩增，得到的pcr产物进行二代测序，对测序结果进行数据分析，得到风疹病毒全长基因组。

16、优选的，所述对测序结果进行数据分析的方法，包括对测序的原始数据进行初步过滤，得到clean reads；

17、将所述clean reads去除宿主基因序列，得到的序列比对到病毒基因组中，组装得到contig序列；

18、将所述contig序列再次去除宿主基因序列后比对到病毒基因组序列上，得到病毒分型排序的数据；

19、将病毒分型排序的数据比对到参考基因组上，经变异位点修正，得到风疹病毒全长基因组。

20、本发明提供了一种用于风疹病毒全长基因组检测的捕获探针，核苷酸序列如seqid no：1～seq id no：796所示。首先本发明提供的捕获探针解决gc含量异常带来的检测困难。风疹病毒基因组序列的特点是gc含量高，全基因组gc含量约为70％，部分区域gc含量可高达80％。使用现有设计引物扩增后进行一代测序，然后拼接基因组全长的手段，往往因gc异常问题无法实现。其次所述捕获探针能覆盖所有毒株的基因组全长序列。由于病毒基因组存在变异的问题，常规一代测序无法实现使用一套引物完成所有株病毒的基因组序列检测。而本发明所述探针杂交捕获结合二代测序的方法，可以使用一套探针体系达成对风疹病毒所有株的覆盖。再次所述捕获探针的通量高。使用探针杂交捕获体系结合二代测序的技术，可实现超多样本同时测序，较常规pcr方法，具有通用高、简便快捷的优势。最后利用所述捕获探针捕获目标区域dna保证基因组序列覆盖度高。使用探针杂交捕获体系结合二代测序的技术，对任意风疹病毒基因组序列，均可以实现近100％的基因组覆盖。

21、本发明提供了一种用于风疹病毒全长基因组检测的试剂盒，包括所述捕获探针、链霉亲和素标记的磁珠和文库杂交反应试剂。所述试剂盒的使用能够得到囊括风疹病毒全基因组信息，一套试剂盒即可完成对风疹病毒不同型别全基因组覆盖。在获得风疹病毒全基因组信息的基础上，可以建立大量样本株全基因组数据库，对于风疹病毒爆发区域的病毒型别溯源起到重要作用。基于所述试剂盒对于风疹病毒基因组上任何位点的新发突变，能实现突变的有效检出，准确实现对风疹病毒变异的监测。

技术特征：

1.一种用于风疹病毒全长基因组检测的捕获探针，其特征在于，所述捕获探针的核苷酸序列如seq id no：1～seq id no：796所示。

2.根据权利要求1所述捕获探针，其特征在于，所述捕获探针上标记有生物素。

3.一种用于风疹病毒全长基因组检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述捕获探针、链霉亲和素标记的磁珠和文库杂交反应试剂。

4.根据权利要求3所述用于风疹病毒全长基因组检测的试剂盒，其特征在于，所述文库杂交反应试剂包括以下至少一种试剂：targetseqhyb buffer v2、hyb human block、blocking oligo和rnase酶抑制剂。

5.根据权利要求3或4所述用于风疹病毒全长基因组检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括rna片段化试剂、反转录反应试剂、cdna二链合成反应试剂、接头连接试剂、纯化试剂、pcr预反应试剂和捕获后pcr扩增反应试剂。

6.根据权利要求5所述用于风疹病毒全长基因组检测的试剂盒，其特征在于，所述pcr预反应试剂包括含udg酶的pcr mastermix和/或udi引物；

7.权利要求1或2所述捕获探针或权利要求3～6中任意一项所述试剂盒在风疹病毒全长基因组检测、风疹病毒基因组变异监测和/或风疹病毒基因组溯源分析中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述应用中，利用所述试剂盒获得风疹病毒全长基因组，得到风疹病毒基因组的变异信息，所述变异信息包括单碱基突变和插入缺失突变；通过将所述变异信息与数据库中基因组序列比对分析，实现风疹病毒基因组变异监测和/或溯源分析的目的；

9.一种基于权利要求1或2所述捕获探针和二代测序检测风疹病毒全长基因组的方法，其特征在于，包括以下步骤：

10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述对测序结果进行数据分析的方法，包括对测序的原始数据进行初步过滤，得到clean reads；

技术总结本发明提供了一种用于风疹病毒全长基因组检测的捕获探针及其试剂盒和应用，属于基因组测序技术领域。一种用于风疹病毒全长基因组检测的捕获探针，核苷酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：796所示。本发明还提供了一种基于所述捕获探针和二代测序进行风疹病毒基因组全长检测的方法，所述捕获探针不仅对任意风疹病毒实现100％的基因组覆盖，而且还可以依赖该方法获得的风疹病毒基因组序列信息实现风疹病毒变异监测和病毒型别溯源的目的。技术研发人员：朱贞,毛乃颖,崔爱利,张燕,钱程,刘莹,高艺轩,李崇扬,林怡彤受保护的技术使用者：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所技术研发日：技术公布日：2024/12/2