一种TRAP染色试剂组、细胞染色方法及切片染色方法与流程

本发明涉及细胞染色，尤其涉及一种trap染色试剂组、细胞染色方法及切片染色方法。

背景技术：

1、抗酒石酸盐的酸性磷酸酶(trap)试剂盒是一种用于快速、方便地检测血液、骨髓或组织中的酸性磷酸酶活性的试剂盒，其包含多个试剂组。trap是一种高度保守的含铁糖蛋白酶，在细胞信号转导、细胞增殖和分化中发挥重要作用，在肺泡巨噬细胞和破骨细胞中高表达。血液中大部分抗酒石酸酸性磷酸酶来自破骨细胞，这是破骨细胞活性的良好标志。

2、市面上现有的其他试剂盒的试剂组存在一些问题，如染色不深，难以看清细胞核的情况，需要另外自行准备试剂，或者试剂组中的试剂种类较多，增加了加样难度。因此，开发一种简便且可以清晰染色的trap试剂组成为了我们的目标。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术所述的至少一种缺陷，本发明提供一种trap染色试剂组、细胞染色方法及切片染色方法。

2、本发明为解决其问题所采用的技术方案是：

3、一种trap染色试剂组，包括：包括试剂a、试剂b、试剂c和试剂d，其中：试剂a为固定液，包含以下成分：柠檬酸溶液、丙酮、10％福尔马林；试剂b为亚硝酸钠溶液，包含以下成分：亚硝酸钠、无菌超纯水；试剂c为gbc溶液，包含以下成分：邻氨基偶氮甲苯、5n盐酸；试剂d为染色混合液，包含以下成分：萘酚as-bi磷酸盐溶液、酒石酸溶液、乙酸钠溶液。

4、通过采用上述方案，该试剂组都是配置好的完成品，不需要另外准备其他的试剂，实验方便，使用便利。

5、进一步地，所述试剂a中，所述试剂a中，所述固定液的配方质量比为：柠檬酸溶液:丙酮:10％福尔马林＝(3.1-3.4):(13.5-13.8):1。

6、进一步地，所述柠檬酸溶液的配方质量体积比为:柠檬酸(mg):柠檬酸钠(mg):氯化钠(mg):无菌超纯水(m l)＝(8.9-9.2):(3.1-3.4):1:(1.3-1.6)，调节ph值为6.5。

7、进一步地，所述试剂b中，所述试剂b中，所述亚硝酸钠溶液的配方质量体积比为：亚硝酸钠(mg):无菌超纯水(ml)＝(5.3-5.6):1。

8、进一步地，所述试剂c中，所述gbc溶液的配方质量体积比为：邻氨基偶氮甲苯(mg):5n盐酸(ml)＝(4.4-4.7):1。

9、进一步地，所述试剂d中，所述萘酚as-bi磷酸盐溶液的配方质量体积比为：萘酚as-bi磷酸盐(mg):n,n二甲基甲酰胺(ml)＝(16.1-16.4):1。

10、进一步地，所述试剂d中，所述酒石酸溶液的配方质量体积比为：酒石酸钾钠四水合物(g):硫酸钠(g):无菌超纯水(ml)＝1:(4.5-4.8):(30.2-30.5)，调节ph值为6.8。

11、进一步地，所述试剂d中，所述乙酸钠溶液的配方质量体积比为：乙酸钠(g):无菌超纯水(m l)＝1:(3.8-4.1)，调节ph值为6.5。

12、进一步地，所述trap染色试剂组由试剂a、试剂b、试剂c和试剂d构成，其中，所述固定液由柠檬酸溶液、丙酮、10％福尔马林构成，所述亚硝酸钠溶液由亚硝酸钠和无菌超纯水构成；所述gbc溶液由邻氨基偶氮甲苯、5n盐酸构成；所述染色混合液由萘酚as-bi磷酸盐溶液、酒石酸溶液、乙酸钠溶液构成。

13、一种细胞染色的方法，包括以下步骤：s1，吸掉培养基，加入1xpbs清洗一遍，去掉pbs；s2，加入试剂a，保留30秒固定细胞；s3，弃掉试剂a，加入1xpbs清洗，需要完全覆盖孔底；s4，准备染色液：s41，将体积比为1:1的试剂b和试剂c混匀，室温下保持2分钟；s42，将体积比为9:115的试剂d和双蒸水混合；s43，将s41和s42的两种溶液以体积比为5:248进行混合；s5，去掉s3中的pbs，加入s4中准备的染色液，37℃孵育40-60min；s6，去掉染色液，加入1xpbs,直接拍照片或4-8℃保存。

14、通过采用上述方案，实验步骤简单，只需要6步操作即可完成实验，且每个试剂稳定，室温存放也不会影响其染色效果。

15、一种切片染色的方法，包括以下步骤：s1，标本预处理，将骨石蜡切片放入56℃温箱中孵育高于1小时，去除石蜡并还水后浸洗备用；或将骨冰冻切片在室温下解冻放置高于15分钟，浸泡并洗涤后备用；s2，预配染色试剂：s21，将体积比为1:1的试剂a和试剂b混匀，室温下保持2分钟；s22，将体积比为57:736的试剂c和双重去离子水混合；s23，将s21和s22的两种溶液以体积比为16:793进行混合；s3，将s23混合后的染色试剂在37℃温箱中放置20-30min；s4，将经过s3处理的染色试剂覆盖于s1中的骨石蜡切片或骨冰冻切片表面，37℃孵育10-15分钟；s5，用双重去离子水清洗5-10分钟，取试剂d复染15-30秒，自来水清洗2-3次后干片，再次浸泡在二甲苯中脱水2次，每次5分钟，随后封片并4℃保持。

16、通过采用上述方案，实验步骤简单，染色效果良好。

17、综上所述，本发明提供的一种trap染色试剂组、细胞染色方法及切片染色方法具有如下技术效果：

18、1.试剂组操作简便，无需特殊的实验技能和设备，适合实验室和临床研究使用；

19、2.检测方法的检测结果准确可靠，能够准确地反映细胞中的trap活性，与传统的检测方法相比，具有更高的敏感性和特异性，破骨细胞染色后的形态清晰，细胞核的数量和分布情况明显，甚至还可以通过染色情况判断细胞当时的活动情况。

技术特征：

1.一种trap染色试剂组，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的一种trap染色试剂组，其特征在于，所述试剂a中，所述固定液的配方质量比为：柠檬酸溶液:丙酮:10％福尔马林＝(3.1-3.4):(13.5-13.8):1；

3.根据权利要求1所述的一种trap染色试剂组，其特征在于，所述试剂b中，所述亚硝酸钠溶液的配方质量体积比为：亚硝酸钠(mg):无菌超纯水(ml)＝(5.3-5.6):1。

4.根据权利要求1所述的一种trap染色试剂组，其特征在于，所述试剂c中，所述gbc溶液的配方质量体积比为：邻氨基偶氮甲苯(mg):5n盐酸(ml)＝(4.4-4.7):1。

5.根据权利要求1所述的一种trap染色试剂组，其特征在于，所述试剂d中，所述萘酚as-bi磷酸盐溶液的配方质量体积比为：萘酚as-bi磷酸盐(mg):n,n二甲基甲酰胺(ml)＝(16.1-16.4):1。

6.根据权利要求1所述的一种trap染色试剂组，其特征在于，所述试剂d中，所述酒石酸溶液的配方质量体积比为：酒石酸钾钠四水合物(g):硫酸钠(g):无菌超纯水(ml)＝1:(4.5-4.8):(30.2-30.5)，调节ph值为6.8。

7.根据权利要求1所述的一种trap染色试剂组，其特征在于，所述试剂d中，所述乙酸钠溶液的配方质量体积比为：乙酸钠(g):无菌超纯水(ml)＝1:(3.8-4.1)，调节ph值为6.5。

8.根据权利要求1所述的一种trap染色试剂组，其特征在于，所述trap染色试剂组由试剂a、试剂b、试剂c和试剂d构成，其中，所述固定液由柠檬酸溶液、丙酮、10％福尔马林构成，所述亚硝酸钠溶液由亚硝酸钠和无菌超纯水构成；所述gbc溶液由邻氨基偶氮甲苯和5n盐酸构成；所述染色混合液由萘酚as-bi磷酸盐溶液、酒石酸溶液、乙酸钠溶液构成。

9.一种利用权利要求1-8任一项所述的trap染色试剂组进行细胞染色的方法，其特征在于，包括以下步骤：

10.一种利用权利要求1-8任一项所述的trap染色试剂组进行切片染色的方法，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结本发明公开了一种TRAP染色试剂组、细胞染色方法及切片染色方法，包括：包括试剂A、试剂B、试剂C和试剂D，其中：试剂A为固定液，包含以下成分：柠檬酸溶液、丙酮、10％福尔马林；试剂B为亚硝酸钠溶液，包含以下成分：亚硝酸钠、无菌超纯水；试剂C为GBC溶液，包含以下成分：邻氨基偶氮甲苯、5N盐酸；试剂D为染色混合液，包含以下成分：萘酚AS‑B I磷酸盐溶液、酒石酸溶液、乙酸钠溶液。本发明提供的TRAP染色试剂组都是配置好的完成品，不需要另外准备其他的试剂，实验方便，使用便利。技术研发人员：刘建忠,詹灵芝,曹雪梅受保护的技术使用者：杭州炀明生物技术有限公司技术研发日：技术公布日：2024/12/2