一种塑料水解酶ThPETase突变体及其应用的制作方法

本发明属于酶工程，具体涉及一种塑料水解酶thpetase突变体及其应用。

背景技术：

1、塑料污染已成为全球范围内亟待解决的重要环境问题，引起了广泛的社会关注。在众多塑料材料中，聚己二酸/对苯二甲酸丁二醇酯（pbat）作为一种新型且备受关注的生物可降解塑料，正逐渐成为解决塑料污染问题的关键手段。pbat通过1,4-丁二醇、己二酸和对苯二甲酸三者的聚合反应合成，其独特的分子结构赋予了其出色的柔韧性和生物相容性，同时，其优良的可加工性能使得pbat在包装材料领域具有显著优势，尤其是在生产高质量包装薄膜、塑料薄膜以及一次性餐具等方面展现出广阔的应用前景。

2、然而，尽管pbat被设计为能够在自然环境中通过微生物的酶促作用实现生物降解，从而减轻对传统塑料污染的负担，但实际情况却不尽如人意。在自然土壤条件下，pbat的降解速率相对较慢，这主要是因为能够有效催化pbat水解的微生物种类较为稀少。这一局限性不仅限制了pbat作为生物降解材料的广泛应用，同时也延缓了其在自然环境中的降解过程，进而可能加剧环境污染问题。

3、因此，针对pbat塑料的高效水解酶的开发成为当前环境科学与生物技术领域亟待解决的重要课题。发掘新的高效的pbat水解酶不仅有望显著加速pbat在自然条件下的降解速度，提高生物降解效率，还有助于促进pbat废弃物的资源化利用，减少对自然生态的负面影响。

技术实现思路

1、针对现有技术中对于可高效水解pbat塑料的酶的开发不足的缺陷，本发明提供了一种塑料水解酶thpetase突变体及其应用，具体技术方案如下：

2、第一方面，本发明提供了塑料水解酶thpetase突变体，所述塑料水解酶thpetase突变体由seq id no.1所示氨基酸序列的第48位、第204位、第213位、第214位、第253位中的多点进行突变得到。

3、进一步地，所述塑料水解酶thpetase突变体的突变形式为下述中的一种：

4、（1）seq id no.1所示氨基酸序列的第204位天冬氨酸突变为半胱氨酸，第253位谷氨酸突变为半胱氨酸；

5、（2）seq id no.1所示氨基酸序列的第48位天冬酰胺突变为天冬氨酸，第204位天冬氨酸突变为半胱氨酸，第253位谷氨酸突变为半胱氨酸；

6、（3）seq id no.1所示氨基酸序列的第204位天冬氨酸突变为半胱氨酸，seq idno.1所示氨基酸序列的第213位亮氨酸突变为苏氨酸，第253位谷氨酸突变为半胱氨酸；

7、（4）seq id no.1所示氨基酸序列的第48位天冬酰胺突变为天冬氨酸，第204位天冬氨酸突变为半胱氨酸，第213位亮氨酸突变为苏氨酸，第214位丝氨酸突变为脯氨酸；

8、（5）seq id no.1所示氨基酸序列的第204位天冬氨酸突变为半胱氨酸，seq idno.1所示氨基酸序列的第214位丝氨酸突变为脯氨酸，第253位谷氨酸突变为半胱氨酸；

9、（6）seq id no.1所示氨基酸序列的第48位天冬酰胺突变为天冬氨酸，第204位天冬氨酸突变为半胱氨酸，第213位亮氨酸突变为苏氨酸，第214位丝氨酸突变为脯氨酸，第253位谷氨酸突变为半胱氨酸。

10、本发明通过对来源于嗜热微生物 thermobifida halotolerans的蛋白thpetase（genebank id: wp_243597587.1）进行突变，得到了对于pbat（聚己二酸/对苯二甲酸丁二醇酯）具有水解活性的突变体，而野生型thpetase几乎不具有对于pbat的水解活性，并且对得到的突变体进行热稳定性的测试，发现进行本申请所提供的突变方式突变后的thpetase，热稳定性具有较大幅度的提升。

11、第二方面，本发明提供了上述的塑料水解酶thpetase突变体的编码基因。

12、第三方面，本发明提供了一种重组载体，包含上述的编码基因。

13、第四方面，本发明提供了一种基因工程菌，包含上述的编码基因。

14、第五方面，本发明提供了上述塑料水解酶thpetase突变体，或上述基因工程菌在降解pbat塑料中的应用。

15、进一步地，所述应用的途径为：

16、向含有pbat塑料的溶液中加入塑料水解酶thpetase突变体后，进行降解反应。

17、进一步地，所述pbat塑料为pbat粉末或pbat塑料薄膜。

18、进一步地，以pbat塑料为基准，按质量百分数计，塑料水解酶thpetase突变体的添加量为0.01%~0.1%；所述反应的温度为30~55℃；时间为1小时到1个月；所述溶液的ph值为7.5~8.5。

19、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

20、本发明在野生型thpetase的基础上进行分子改造，在野生型thpetase几乎不具有对于pbat的水解活性的情况下，本发明得到的突变体具有明显的对于pbat的水解能力，37℃下，2周即可将pbat材质的塑料薄膜水解成粉末，并且本发明得到的突变体相比野生型在热稳定性方面具有较大幅度的提升，具有巨大的工业应用前景。

技术特征：

1. 塑料水解酶thpetase突变体，其特征在于，所述塑料水解酶thpetase突变体由seqid no.1所示氨基酸序列的第48位、第204位、第213位、第214位、第253位中的多点进行突变得到。

2.根据权利要求1所述的塑料水解酶thpetase突变体，其特征在于，所述塑料水解酶thpetase突变体的突变形式为下述中的一种：

3.如权利要求2所述的塑料水解酶thpetase突变体的编码基因。

4.一种重组载体，其特征在于，包含如权利要求3所述的编码基因。

5.一种基因工程菌，其特征在于，包含如权利要求3所述的编码基因。

6.如权利要求1所述的塑料水解酶thpetase突变体，或如权利要求5所述的基因工程菌在降解pbat塑料中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用的途径为：

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述pbat塑料为pbat粉末或pbat塑料薄膜。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，以pbat塑料为基准，按质量百分数计，塑料水解酶thpetase突变体的添加量为0.01%~0.1%；所述反应的温度为30~55℃。

技术总结本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种塑料水解酶ThPETase突变体及其应用，所述塑料水解酶ThPETase突变体由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第48位、第204位、第213位、第214位、第253位中的多点进行突变得到。本发明在野生型ThPETase的基础上进行分子改造，在野生型ThPETase几乎不具有对于PBAT的水解活性的情况下，本发明得到的突变体具有明显的对于PBAT的水解能力，37℃下，2周即可将PBAT材质的塑料薄膜水解成粉末，并且本发明得到的突变体相比野生型在热稳定性方面具有较大幅度的提升，具有巨大的工业应用前景。技术研发人员：徐盛春,李新佳,陶晓园受保护的技术使用者：湘湖实验室（农业浙江省实验室）技术研发日：技术公布日：2024/12/2