基于Cas酶的电化学发光纳米探针、传感器、检测方法及检测用试剂盒与流程

本发明涉及使用了半导体聚合物量子点(pdots)的基于cas酶的电化学发光(ecl)纳米探针、传感器、检测方法和检测用试剂盒。

背景技术：

1、电化学发光(ecl)是一种电化学引发的能量弛豫过程，由于激发模式与信号检测分离，因此具有电化学可控性和低背景的特点。由于电化学发光技术相对简便的时间和空间控制，利用电荷耦合器件(ccd)相机进行信号采集的电化学发光成像已快速发展并被用于多种目标分子的分析，并已扩展应用于基因毒素筛选、免疫测定、指纹分析、细胞检测、和反应机制的研究。电化学发光检测方法保留了化学发光方法所具有的灵敏度高、线性范围宽、观察方便和仪器简单等优点；同时还具有化学发光方法无法比拟的优点，例如重现性好、试剂稳定、控制容易和一些试剂可以重复使用等。

2、目前的电化学发光成像多采用钌和铱络合物等无机配合物发光体系，但是这些络合物在水溶液中的不溶性以及所含的重金属导致的细胞毒性问题限制了其在生物分析中的应用。

3、半导体聚合物量子点(semiconducting polymer dots，pdots)是一类新型的有机荧光材料，由于其无毒并具有大的光吸收截面、高荧光量子效率、光稳定性以及生物相容性等特征已被广泛尝试用于生物检测、细胞生物学和临床医学等。

4、现有技术中进行了将半导体聚合物量子点制成荧光探针以用于电化学发光检测的多种尝试(参见非专利文献1、2)。以半导体聚合物量子点形式制备的电化学发光传感器相对于传统的电化学发光平台例如具有发光亮度更高、光稳定性更好、生物相容性更好等优点。

5、但是，电化学发光平台作为信号检测的平台，本身不具备对待测目标分子的识别功能，通常需要配合特殊的探针使用才能实现对特定目标分子的识别和分析，故其对于待测物的识别特异性/准确性取决于其所配合的特殊探针。这类探针的选择以及可以靶向的核酸序列通常由于特异性的要求而受到限制，即检测的准确度/特异性有限，不便于对任意的核酸序列进行检测。例如，非专利文献2中通过将pdots连接上dna或者rna寡核苷酸探针，由此实现对微量核酸分子的识别和分析。

6、cas酶是一种具有checkpoint机制的核酸识别和剪切酶蛋白，从而使得其具有单碱基分辨准确性，基于cas酶的核酸检测的最大的优势在于利用cas酶特有的checkpoint机制，使得对于核酸的检测可以达到单碱基的分辨灵敏度，另外通过设计并合成cas酶的引导rna(grna)可以低成本地检测任意的核酸序列。

7、例如，非专利文献3中设计了一种基于cas12a的电化学发光生物传感器并将其用于人乳头瘤病毒(hpv-16)dna的检测。

8、这样的技术虽然具有超高的核酸识别准确性，但是其对微量核酸识别的灵敏性不够，所以通常还需要进行核酸的预扩增以提高检测限。预扩增的使用虽然提高了检测的灵敏度，但也会降低检测的准确性，因为大量的核酸片段的扩增可能造成气溶胶污染从而产生假阳性结果。此外，预扩增步骤也使得检测步骤变得复杂和延长检测时间。

9、现有技术文献

10、非专利文献

11、非专利文献1：ningning wang,yaqiang feng，et al.；electrochemiluminescent imaging for multi-immunoassay sensitized by dual dn aamplification of polymer dot signal；anal.chem.2018,90,7708-7714。

12、非专利文献2：guangming li et al.；ratiometric fluorescent detect ion ofmirna-21via ph-regulated adsorption of dna on polymer do ts and exonucleaseiii-assisted amplification，analytica chimica acta 1

13、232(2022)340450。

14、非专利文献3：peng-fei liu et al.；cas12a-based electrochemiluminescence biosensor for target amplification-free dna detection；biosens orsand bioelectronics 176(2021)112954。

技术实现思路

1、发明所要解决的课题

2、如上所述，cas酶具有可以靶向任意核酸片段的优势，但是其自身的灵敏度有限，需要结合其它的技术以提高灵敏度(如普遍使用的预扩增)，但这样又会造成假阳性的产生，也难以对原始的核酸进行定量。电化学发光方法、例如基于半导体聚合物量子点(pdots)的电化学发光检测方法具有可进行信号放大，准确性好，可以定量的特点，并且不需要进行预扩增，能够避免气溶胶导致的假阳性。但是，其高度依赖所配合使用的寡核苷酸探针，检测的准确度/特异性有限，不便于对任意的核酸序列进行检测。

3、本发明是鉴于上述情况而完成的，本发明的目的在于提供一种具有高灵敏度、高准确性和特异性并且高灵活性的电化学发光检测方法。

4、本发明的发明人针对上述现有技术中存在的问题进行了细致深入的反复研究，结果发现，通过将cas酶体系应用于基于半导体聚合物量子点(pdots)的电化学发光方法，构建基于cas酶的电化学发光检测方法，能够弥补基于pdots的ecl以及基于cas12的方法各自的不足，从而提供无需扩增的、具有高灵敏度、高准确性和特异性并且高灵活性的电化学发光检测方法。

5、具体而言，通过cas蛋白和crrna的复合物(cas蛋白-crrna)来对目标核酸进行识别及激活cas酶活性，使用具有淬灭剂分子修饰的寡核苷酸链(q-dna)对pdots颗粒进行修饰制备纳米探针，利用被目标核酸激活的cas蛋白-crrna的剪切活性对纳米探针上的q-dna进行剪切，由此实现对pdots ecl信号的开关控制。此外，通过采用cas酶和exo iii双酶催化体系，还能够进一步提高pdots ecl信号开关的灵敏度。

6、用于解决课题的方法

7、本发明提供以下的技术方案。

8、＜1＞一种电化学发光纳米探针的制备方法，其包含以下工序：

9、pdots纳米颗粒合成工序，使共轭聚合物与共聚物分子聚合，合成pdo ts纳米颗粒，和

10、pdots纳米颗粒修饰工序，使用具有淬灭剂分子修饰的寡核苷酸链对得到的pdots纳米颗粒进行修饰。

11、＜2＞根据＜1＞所述的制备方法，其中，

12、所述共轭聚合物为pdhf、pfo、ppe、meh-ppv、pfpv、pfbt、cn-ppv、pf-dbt5、或pboc；

13、

14、＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的制备方法，其中，

15、所述共聚物分子为聚苯乙烯-聚丙烯酸嵌段共聚物(ps-paa)、聚苯乙烯-马来酸酐共聚物(psma)或聚(异丁烯-alt-马来酸酐)(pima)，

16、

17、    

18、＜4＞根据＜1＞～＜3＞中任一项所述的制备方法，其中，

19、所述共轭聚合物与所述共聚物分子通过纳米共沉淀法合成pdots颗粒。

20、＜5＞根据＜1＞～＜4＞中任一项所述的制备方法，其中，

21、所述淬灭剂分子为黑洞淬灭剂、黑暗淬灭剂、或胺反应性淬灭剂。

22、＜6＞根据＜1＞～＜5＞中任一项所述的制备方法，其中，

23、所述寡核苷酸链为单链dna。

24、＜7＞根据＜6＞所述的制备方法，其中，

25、所述单链dna为发夹结构的单链dna。

26、＜8＞根据＜1＞～＜5＞中任一项所述的制备方法，其中，

27、所述寡核苷酸链为双链dna。

28、＜9＞一种电化学发光纳米探针，其是通过＜1＞～＜8＞中任一项所述的制备方法制备的。

29、＜10＞一种电化学发光传感器，其是通过将＜9＞所述的电化学发光纳米探针滴加到工作电极上而得到的。

30、＜11＞根据＜10＞所述的电化学发光传感器，其中，所述工作电极为选自玻碳电极、氧化铟锡电极、丝网印刷电极中的一种。

31、＜12＞一种基于cas酶的电化学发光检测方法，其包含以下工序：

32、酶促反应工序：将待测样品加入cas酶催化体系中，所述cas酶催化体系包含能够与目标核酸结合的引导核酸；

33、pdots芯片制作工序：将＜9＞所述的电化学发光纳米探针固定到工作电极上；和

34、样品检测工序：将酶促反应工序中得到的反应溶液加入到所述工作电极上，采集电化学发光信号并进行分析。

35、＜13＞根据＜12＞所述的电化学发光检测方法，其中，

36、所述cas酶包含选自cas12(va型)、cas13(vi型)和cas14(vf型)中的至少一种cas蛋白。

37、＜14＞根据＜13＞所述的电化学发光检测方法，其中，

38、所述cas酶包含选自cas12a、cas13a、cas13b、cas14a、cas14b和cas14c中的至少一种cas蛋白。

39、＜15＞根据＜12＞～＜14＞中任一项所述的电化学发光检测方法，其中，

40、所述电化学发光纳米探针中的寡核苷酸链为单链dna。

41、＜16＞根据＜15＞所述的电化学发光检测方法，其中，

42、所述单链dna为发夹结构的单链dna。

43、＜17＞根据＜12＞～＜14＞中任一项所述的电化学发光检测方法，其中，

44、所述电化学发光纳米探针中的寡核苷酸链为双链dna，并且在所述酶促反应工序中进一步使用exo iii酶。

45、＜18＞一种基于cas酶的电化学发光检测用试剂盒，其包含：

46、酶促反应溶液：其包含cas酶催化体系，所述cas酶催化体系包含能够与目标核酸结合的引导核酸；和

47、pdots一次性检测芯片：其在丝网印刷的三电极片的工作电极上固定有＜9＞所述的电化学发光纳米探针。

48、＜19＞根据＜18＞所述的电化学发光检测用试剂盒，其中，

49、所述电化学发光纳米探针中的寡核苷酸链为双链dna，并且所述酶促反应溶液还包含exo iii酶。

50、发明效果

51、通过本发明，可提供一种无需扩增的、具有高灵敏度、高准确性和特异性并且高灵活性的电化学发光检测方法。具体而言：

52、(1)通过结合pdot纳米探针及cas酶体系的连带切割活性，能够在无需预扩增的前提下，提高对目标核酸的检测灵敏度；

53、(2)通过cas酶的单碱基分辨特异性，能够提高ecl信号检测的准确性，避免错误识别目标核酸导致的假阳性信号；

54、(3)通过定制化的cas酶的引导rna(crrna)，能够实现对任意核酸序列的靶向，和基于ecl的高灵敏信号输出；

55、(4)在采用dsdna刚性结构连接淬灭基团的情况下，通过采用cas12和exo iii双酶催化体系，能够扩展cas12酶的剪切应用范围，并有希望进一步提高ecl检测的灵敏度。

56、(5)本发明的ecl纳米探针还可制成一次性检测芯片，因此有利于poct(即时检验，point-of-care testing)，能够实现方便、快捷的核酸检测。