用于犬个体识别和亲权鉴定的STR分型技术的制作方法

本技术涉及基因检测，具体涉及一种用于犬个体识别和亲权鉴定的str分型方法、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、我国有超5000万只宠物犬，其作为人类工作动物或伴侣动物，与人类生活密不可分。正因于此，犬不可避免的与某些案事件的发生密切相关，例如，脱落的犬毛发可能在涉案的不同个体间转移，可用于将嫌疑人和犯罪现场、嫌疑人和受害人或受害人与犯罪现场等相互关联；由于养犬数目的增加，犬伤人案件也屡见不鲜，而实现犬的精准个体识别和亲权鉴定，有利于还原案事件原貌，重建案事件现场，确定责任人，并为此类案事件的审理提供关键证据。此外，犬作为伴侣动物在各个不同的家庭，给我们带来很多的陪伴和欢乐的同时，在宠物市场交易中也占据重要地位，其中一些名贵犬种在交易过程中需要进行dna鉴定，以明其血统。

2、短串联重复序列(short tandem repeat,str)也叫微卫星dna，是基因组上一类重复序列，按照重复单位碱基数可分为二核苷酸序列以及三、四、五和六核苷酸序列。str是法医dna分析中应用最广泛的遗传标记类型，在个体识别和亲权鉴定中发挥了重要作用。其中基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,pcr)和毛细管电泳(capillaryelectrophoresis，ce)平台的str检测灵敏度高、结果准确，是当前str分析的金标准。而基于pcr-ce技术的str分析也是犬dna检测的主要技术方法。为了更准确和高效的进行犬的管理和涉犬案件的侦查工作，澳大利亚、美国、匈牙利、英国等国家已经开展了犬相关str数据库的构建工作。

3、当前，已有针对10个、11个、15个、17个、24个犬特异性str开发的一系列犬个体识别分型检测体系，这些体系中主要检测二核苷酸和四核苷酸重复单元的str。与此同时，国际动物遗传学学会(international society for animal genetics,isag)为了规范犬的品系和家系追踪，推荐了21个str基因座，可用于家犬的亲权鉴定。最新研究中，研究人员开发包含24个str的复合扩增分型检测体系，对犬群体的累积排除概率为0.9999，但该体系包含基因座同国际其他研究相差较大，不利于实验室间结果比对以及相关技术方法的推广和大规模应用。除此之外，我国可用于犬个体识别和亲权鉴定的str分型技术体系有限。为了弥补犬个体识别和亲权鉴定的技术不足，亟需开发构建犬一种新型str分型技术体系。

技术实现思路

1、为解决前述技术问题，申请人开发了一种灵敏度高、特异性好和稳定性优的犬个体识别/亲权鉴定的str分型技术。

2、本技术的第一目的是寻求一种新的犬个体识别和亲权鉴定的str分型产品或试剂盒；

3、本技术的第二目的是寻求一种犬个体识别和亲权鉴定的str分型检测方法。

4、具体的，本技术采用如下技术方案：

5、本技术首先提供一种用于犬个体识别和亲权鉴定分型的引物组合物，所述引物针对21个犬特异性str基因座；

6、进一步的，所述基因座和大小包括如下：

7、fh2848(131-170nt)、ahth130(188-222nt)、ren64e19(224-248nt)、ren169o18(252-294nt)、inu055(300-355nt)、aht137(75-120nt)、inu030(124-157nt)、ren247m23(164-190nt)、ahth260(195-230nt)、inra21(250-294nt)、ren105l03(300-340nt)、ren162c04(82-122nt)、ahtk253(141-181nt)、ren169d01(190-236nt)、ren54p11(246-282nt)、fh2054(293-353nt)、cxx279(82-130nt)、inu005(140-175nt)、ahtk211(180-225nt)、ahth171(230-268nt)、aht121(279-339nt)。

8、优选的，所述引物组合物针对性别鉴定的基因座amelogenin(90-129nt)。

9、进一步的，所述引物的具体序列如seq id no.1-44所示。

10、进一步的，所述引物被分为4组，且被荧光标记；

11、优选的，所述荧光标记分别为fam、hex、tamra和rox标记：

12、组1：fam蓝色荧光标记：针对基因座amelogenin(90-129nt)、fh2848(131-170nt)、ahth130(188-222nt)、ren64e19(224-248nt)、ren169o18(252-294nt)、inu055(300-355nt)；

13、组2：hex绿色荧光标记：针对基因座aht137(75-120nt)、inu030(124-157nt)、ren247m23(164-190nt)、ahth260(195-230nt)、inra21(250-294nt)、ren105l03(300-340nt)；

14、组3：tamra黄色荧光标记：针对基因座ren162c04(82-122nt)、ahtk253(141-181nt)、ren169d01(190-236nt)、ren54p11(246-282nt)、fh2054(293-353nt)；

15、组4：rox红色荧光标记：针对基因座cxx279(82-130nt)、inu005(140-175nt)、ahtk211(180-225nt)、ahth171(230-268nt)、aht121(279-339nt)。

16、本技术还提供一种用于犬个体识别和亲权鉴定分型的试剂盒，其特征在于，包括前述任一所述的引物组合物。

17、进一步的，所述试剂盒进一步包括：热启动taq dna聚合酶、pcr扩增缓冲液、质控品和内标。

18、本技术还提供前述任一所述的引物组合物在犬个体识别和亲权鉴定分型中的应用，或在制备犬个体识别和亲权鉴定分型试剂盒中的应用。

19、进一步优选的，所述鉴定分型过程中，pcr扩增过体系de退火温度为57±2℃，退火时间为80-90s，延伸时间为5-15min，循环数为29-30个。

20、本技术还提供一种犬个体识别和亲权鉴定分型的方法，通过构建一个包含有22个犬特异性基因座的复合pcr扩增体系，采用荧光pcr扩增结合毛细管电泳检测的方法，对犬特异性的21个str基因座和性别判定amel基因座进行检测，结合毛细管电泳的片段分离技术，在一次实验中实现所有目标基因座的分型，具体可包括如下步骤：

21、利用前所引物组合物进行扩增的步骤，或利用前述任一所述试剂盒进行检测的步骤；进一步的，所述方法进一步包括毛细管电泳和数据分析判读的步骤，最后通过片段大小、基因座的产物峰高比值，确定样本的基因型。

22、与现有技术相比，本技术至少具有如下优势：

23、1)本技术的方法具有极高检测灵敏度，检测体系可实现低至0.1ng的微量犬dna的完整str分型检测；

24、2)本技术分型结果更加准确，体系中21个目标str基因座的目标扩增峰的偏倚均小于0.2nt；

25、3)本技术检测的种属特异性高，体系中所有基因座均有较高犬种属特异性，检测中对于猫、小鼠、鸽子、马、牛、大肠杆菌、鱼和mdck细胞系等非犬来源dna无产物峰。

26、4)本技术检材适用性强，体系对于多种不同类型检材，不同提取方法获得的模板dna，均可获得准确的str分型结果，检材适用性强。而且相比于以往方法，本技术稳定性更高，体系在不同引物浓度、缓冲液浓度、退火温度、退火时间、终延伸时间条件下，多种不同类型的热循环仪器上进行扩增反应，结果都准确且稳定。综合而言，本技术在应用过程中可重复性和权威性明显优于以往技术。

27、5)本技术体系可在3h内实现体系中所有基因座的准确扩增和检测，速度快，相关试剂耗材均可大规模生产，成本低。