基于MnTiO3@Pd纳米粒比色的磁珠适配体传感器

本发明属于生物医学，尤其涉及一种基于mntio3@pd纳米粒比色的磁珠适配体传感器、构建方法及应用。

背景技术：

1、内毒素是革兰氏阴性杆菌细胞壁的成分，它由脂多糖a和一个糖链组成。细菌死亡后，将内毒素释放到血浆中，引发毒素效应，例如发热、感染性休克、多器官功能衰竭，甚至死亡。内毒素的污染危害着人类的健康，尤其是在血液制品、可注射药物、医疗敷料和可植入设备中的污染。目前，内毒素的检测方法主要有鲎变形细胞溶解物试验(lal试验)和生物传感器，其中lal试验基于酶反应，容易受蛋白酶的干扰。

2、适配体作为一种单核苷酸链，能够特异性的识别分子生物标志物，相较于抗体，适配体具有良好的特异性、亲和力和稳定性。近些年，纳米材料在医学领域的应用受到研究者的关注。mntio3是一种三元纳米碟，它作为催化剂参与过氧化氢介导的氧化降解，使亚甲基蓝从蓝色变为无色或颜色变浅。钯纳米粒(pd)一定程度也能催化过氧化氢的反应，还可以通过pd-nh2化学键结合核苷酸单链。

3、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

4、(1)传统的检测方法在灵敏度和特异性方面存在局限，特别是在复杂的样本如血液制品中。

5、(2)lal试验容易受到外部条件如蛋白酶的干扰，影响结果的准确性和可靠性。lal试验需要特定的环境和条件，使得操作复杂并增加了成本。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于mntio3@pd纳米粒比色的磁珠适配体传感器、构建方法及应用。

2、在本发明设计中，我们构建了一种基于mntio3@pd纳米粒比色的磁珠适配体传感器，用于定量和定性检测内毒素。在过氧化氢溶液的存在下，mntio3@pd纳米粒能使亚甲基蓝从蓝色变为无色或颜色变浅，该变化可以通过肉眼初步定性，还可以通过紫外分光光度计测定吸光度进行定量检测。若待测血浆中有内毒素，检测液中的适配体(apt)会与其结合，使溶液中形成的“磁珠修饰的捕获探针(mb-cp)-apt-mntio3@pd纳米粒修饰的信号探针(mntio3@pd纳米粒-sp)”三明治夹心结构变少，最终导致吸光度的差值越大。

3、基于mntio3@pd纳米粒比色的磁珠适配体传感器的构建方法，所述基于mntio3@pd纳米粒比色的磁珠适配体传感器的构建方法包括以下步骤：

4、s1，利用一步水热法合成mntio3纳米碟，然后将pd纳米粒还原到纳米碟上以合成mntio3@pd纳米粒；

5、s2，根据内毒素适配体的核苷酸序列设计捕获探针和信号探针；

6、s3，合成捕获探针：磁珠修饰的氨基化核苷酸单链；

7、s4，利用ssdna与mntio3@pd纳米粒合成信号探针；

8、s5，利用捕获探针和信号探针构建比色适配体传感器。

9、进一步，s1中合成mntio3@pd纳米粒的具体步骤为：

10、s11，配制溶液a：将0.394ml浓度为1.25mmol的异丙醇钛逐滴加入16ml乙二醇中，剧烈搅拌混匀形成混合溶液；

11、s12，配制溶液b：将247.8mg mncl2·4h2o溶于4ml乙二胺；

12、s13，将溶液a倒入溶液b，稍作搅拌混匀后，向混合液中逐滴加入h2o；

13、s14，将混合液加入不锈钢高压釜中，密封后将高压釜放进马弗炉，200度高温加热12小时；

14、s15，待高压釜温度降至室温，将液体转移至离心管中离心，再用无水乙醇和超纯水清洗三次，将所得黄色沉淀用干燥箱烘干。

15、s16，向1mg/ml mntio3纳米碟水溶液中加入10mm na2pdcl4(1ml)，然后向混合溶液中快速加入抗坏血酸，室温环境下搅拌3h，再离心清洗。最后重悬于pbs缓冲液中，置于4度冰箱待用。

16、进一步，s2中内毒素适配体的核苷酸序列为：5’-tttttttttcttctgcccgcctccttcctagccggatcgcgctggccagat gatataaagggtcagccccccaggagacgagataggcggacact-3’；捕获探针的核苷酸序列为：5’-aaaaagtgtccgcctatctcgtctcctggggggctgaccctttatatcatc-3’，信号探针的核苷酸序列为：5’-tggccagcgcgatccggctaggaaggaggcgggcagaagaaaaaaaaagggg-3’。

17、进一步，s4中合成信号探针的具体步骤为：

18、s41，将等体积的ssdna与mntio3@pd纳米粒置于4度冰箱里轻微搅拌过夜，离心后用pbs缓冲液清洗3次；

19、s42，加入1％bsa以封闭其非特异性结合位点，离心后用pbs缓冲液清洗3次；

20、s43，重悬于pbs缓冲液中，置于4度冰箱里待使用。

21、进一步，s5中构建比色适配体传感器的具体步骤为：

22、s51，向ep管中加入定量适配体和靶标，室温下反应2h，然后将上述反应液加入预先准备好的检测试剂中(含有mb-cp和mntio3@pd-sp),室温下反应2h；

23、s52，上述反应结束后，使用磁力架去除未形成三明治夹心结构的组分，并用pbs缓冲液清洗三次，清洗第三次后沉淀物保留；

24、s53，向上述ep管中依次加入0.1mg/ml亚甲基蓝和h2o2；

25、进一步，在构建比色适配体传感器的过程中优化反应条件，对探针和靶标的反应时间和温度，过氧化氢浓度，过氧化氢和亚甲基蓝的体积比，pbs缓冲液的ph进行优化。

26、本发明的另一目的在于提供一种基于mntio3@pd纳米粒比色的磁珠适配体传感器的构建系统，包括：

27、mntio3@pd纳米粒组件：pd纳米粒还原并附着在mntio3纳米碟上形成的复合结构；

28、适配体探针组件：捕获探针，由磁珠修饰的氨基化核苷酸单链构成，其设计依据目标内毒素适配体的核苷酸序列；信号探针，由与mntio3@pd纳米粒结合的单链dna构成；

29、检测与信号转换装置：用于捕捉和分离带有目标分析物的捕获探针，检测经由信号探针引起的颜色变化，从而实现对特定内毒素的定量或定性分析；

30、控制与分析单元：接收检测信号，并对信号进行处理和分析；提供用户界面，显示检测结果并允许用户输入参数或控制测试过程。

31、本发明的另一目的在于提供一种基于mntio3@pd纳米粒比色的磁珠适配体传感器。

32、本发明的另一目的在于提供所述基于mntio3@pd纳米粒比色的磁珠适配体传感器在检测血浆中的内毒素的应用。

33、进一步，利用基于mntio3@pd纳米粒比色的磁珠适配体传感器对不同浓度的靶标进行检测，并建立标准曲线。

34、结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

35、第一，针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：

36、本发明利用mntio3的特性，结合适配体的特异识别功能，设计了一种比色适配体传感器，用于检测血浆中的内毒素。本发明所设计的适配体传感器为内毒素的检测提供一种低成本、高灵敏、快速的方法，并且能够同时进行定量和定性的检测。

37、第二，本发明所设计的适配体传感器，基于mntio3@pd纳米粒在过氧化氢的存在能使亚甲基蓝由蓝色变为无色或颜色变浅的原理，相较于酶催化的比色反应(例如辣根过氧化物酶)，mntio3@pd纳米粒是一种性质和结构稳定的纳米材料，其合成简单、不易被分解、不易受温度环境的影响。本发明所具备的优势为：不仅能在几分钟内快速的通过肉眼判断颜色变化来定性检测内毒素，还能定量检测内毒素的浓度；利用该适配体传感器检测内毒素不需要昂贵的仪器和专业技术人员，方法简单、易操作。

38、第三，本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：

39、高灵敏度和特异性检测：通过利用mntio3@pd纳米粒比色的磁珠适配体传感器，能够实现对血浆中内毒素的高灵敏度和特异性检测。这意味着在医学检验中，可以更准确地检测到细菌死亡释放的内毒素，避免了误差和干扰，提高了检测结果的可信度。

40、快速、低成本、操作简便：与传统的检测方法相比，本发明的传感器具有快速、低成本和操作简便的优势。这使得在医疗实践中能够更加高效地进行内毒素检测，减少了实验室操作的复杂性和成本，提高了检测的实用性。

41、应用于多个医学领域：内毒素的检测在医学领域有着广泛的应用，特别是在血液制品、可注射药物、医疗敷料和可植入设备等方面。因此，该技术方案有望在多个医学领域中找到应用，拓展了其商业化的可能性。

42、抗酶活性的提高：传统的内毒素检测方法中，如鲎变形细胞溶解物试验(lal试验)，是基于酶反应的，容易受蛋白酶的干扰。而本发明采用基于mntio3@pd纳米粒比色的磁珠适配体传感器，结合了适配体的特异性和mntio3纳米碟的催化特性，可能提高了抗蛋白酶的能力，从而提高了检测的可靠性。