一种化妆品原料体外抗痤疮功效评估组合方法与流程

本发明属于化妆品，更具体地，涉及一种化妆品原料体外抗痤疮功效评估组合方法。

背景技术：

1、痤疮是一种常见于面部、胸背部的慢性皮肤疾病，主要表现为粉刺、丘疹、结节或囊肿。由于现阶段人们普遍存在压力激增、作息紊乱、高糖高脂饮食、皮肤清洁不当或自身遗传等情形，导致痤疮诱发率较高。经研究，超过82%的人会有不同程度的痤疮发生。痤疮发生期间伴随的疼痛与不适感，以及后续炎性病变可能导致的红斑、遗留的皮损与瘢痕均会给患者带来较大的身心负担。

2、目前，痤疮明确的发病机制仍未被完全阐明，但相关专家普遍认为引起痤疮的主要因素是：1.皮脂腺过度分泌油脂；2.毛囊皮脂腺导管角化异常；3.痤疮丙酸杆菌等毛囊微生物的定植；4.炎症及免疫反应。除了常规药物治疗，日常合理使用抗痤疮类功效型护肤品也有助于达到辅助防治痤疮的效果。

3、传统的抗痤疮原料体内功效评价主要通过动物模型实现，包括兔耳模型、大鼠模型、墨西哥无毛犬模型等，因上述评价方法成本过高，并未得以推广。然而，化妆品行业目前正在积极推进动物试验“3r”原则，且采用化妆品进行体外抗痤疮操作简便易行，深受消费者推崇。大量文献表明，痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌广泛存在于人体皮肤表面脂质中，是痤疮的重要致病菌，其既能释放与皮脂分泌相关的激素，也能通过损伤表皮细胞的完整性进而造成过度角化形成痤疮，同时痤疮还与炎症和组织损伤有密切的关系。角质形成细胞受痤疮丙酸杆菌刺激后toll样受体尤其是tlr2与tlr4表达升高，可激活下游的信号通路，诱导趋化因子和细胞炎症因子的生成；痤疮的各阶段中均发现大量的炎症介质，作为主要的致痤疮源，痤疮早期，病变部位首先产生促炎因子，促使各类不同炎症细胞向病变局部聚集，后在微生物作用下产生大量炎性因子，引发一系列炎症反应；而炎症的产生还可直接导致痤疮形成后的色素沉着，形成痘印。所以，抗痤疮类功效性化妆品需要通过改善痤疮发生过程中相关菌的抑制、菌刺激后的相关下游反应、及贯穿痤疮发生始终的皮脂分泌异常与炎症反应等多个维度的作用机制来达到预期的效果。

4、现有一些化妆品及其原料抗痤疮功效的评价方法，如：申请号为cn202210890208.x的专利申请公开了一种类痤疮表型的体外重组表皮模型及构建方法，其缺陷是体外重组表皮模型构建时间较长、培养难度与成本较高；申请号为cn202310542376.4的专利申请公开了一种体外痤疮炎症模型及构建方法，其使用的体外痤疮炎症模型为单一细胞模型，评估手段较为单一，可能出现漏筛的情况。显而易见的是，上述提及的化妆品原料体外抗痤疮功效评价模型存在功效评价不够全面，实施成本高、易出现错筛和漏筛的情况。

5、因此，亟需提出一种化妆品原料体外抗痤疮功效评估组合方法，以解决现有的化妆品原料体外抗痤疮功效评价模型存在实施成本高、功效评价不够全面、易出现错筛和漏筛情况的技术问题。进而有助于在高通量的前提下更全面地实现抗痤疮类化妆品原料的开发和筛选。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的主要目的在于提出一种化妆品原料体外抗痤疮功效评估组合方法，旨在解决现有的化妆品原料体外抗痤疮功效评价模型存在实施成本高、功效评价不够全面、易出现错筛和漏筛情况中的至少一个技术问题。

2、为达此目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明提供了一种化妆品原料体外抗痤疮功效评估组合方法，所述组合方法包括如下步骤：

4、步骤s1：建立待评估化妆品原料体外抗菌功效模型并评分，所述评分的分值记作t1；

5、步骤s2：建立待评估化妆品原料体外角质细胞抗痤疮模型并评分，所述评分的分值记作t2；

6、步骤s3：建立待评估化妆品原料体外皮脂腺细胞控油模型并评分，所述评分的分值记作t3；

7、步骤s4：建立待评估化妆品原料raw264.7巨噬细胞抗炎舒缓效果模型并评分，所述评分的分值记作t4；

8、步骤s5：计算总评分的分值并给出化妆品原料体外抗痤疮功效评价结果，所述总评分的分值计算公式如下：

9、；其中，

10、a1为体外抗菌功效模型评分权重系数，a2为体外角质细胞抗痤疮模型评分权重系数，a3为体外皮脂腺细胞控油模型评分权重系数、a4为raw264.7巨噬细胞抗炎舒缓效果模型评分权重系数，此处，a1、a2、a3、a4取值均为0.25；若所述总评分的分值t不小于预设分值时，所述化妆品原料体外抗痤疮功效评价结果为有效，所述预设分值为0.5。

11、优选的，所述步骤s1包括：

12、步骤s11：稳定培养痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌；

13、步骤s12：设置化妆品原料受试物组试管、阳性对照组试管，每组所述化妆品原料受试物组的试管由1至9号试管组成，将灭菌处理后的mh培养基分装于化妆品原料受试物组1至9号试管中，化妆品原料受试物组的1号试管加入3840μg/ml的化妆品原料受试物，2至7号试管依次加入倍半稀释的化妆品原料受试物，8至9号试管不加入化妆品原料受试物，则8号管为阴性对照，9号管为空白对照；阳性对照组则将原料受试物组1至7号试管中的化妆品原料受试物替换为抗生素；

14、步骤s13：将活化好的痤疮丙酸杆菌及金黄色葡萄球菌的菌株分别用生理盐水配制成菌悬液，分别加入不同化妆品原料受试物组的1至8号试管，培养18~24h后，自化妆品原料受试物组1至9号试管分别取100μl液体至96孔细胞培养板测od600nm吸光度，并计算化妆品原料受试物在各浓度下的相对抑菌率，所述相对抑菌率的计算公式如下：

15、相对抑菌率=[1-(as-ab)/(ac-ab)]×100%，其中，

16、as为孔板液体吸光度平均值，其涉及自化妆品原料受试物组的1至7号试管取出的液体；ac为阴性对照孔液体吸光度平均值，其涉及自8号试管取出的液体；ab为空白对照孔吸光度平均值，其涉及9号试管取出的液体；

17、步骤s14：计算各管取出的液体的as值，并计算对应受试物对痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌的相对抑菌率值，针对痤疮丙酸杆菌或金黄色葡萄球菌，若2至4号任一试管对应的相对抑菌率＜40%，则赋0分；若40%≤2至4号任一试管对应的相对抑菌率＜80%，则赋0.3分；若2至4号任一试管对应的相对抑菌率≥80%，则赋1分；当所述2至4号任一试管的化妆品原料受试物针对痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌的赋分之和＞0.5分时，则t1为1分。

18、需要说明的是，选取化妆品原料受试物组的2至4号试管（即化妆品原料受试物的浓度为480μg/ml至1920μg/ml）作为考量相对抑菌率的基础进而对化妆品原料体外抗菌功效模型进行评分的原因在于：2至4号试管对应的化妆品原料受试物浓度在该模型中处于居中位置，在统计学意义上可以排除在端点处可能出现的极端情况，保证了对于化妆品原料体外抗菌功效模型评分的可参考性；另外，上述操作方式的成本可控。

19、需要说明的是，所述相对抑菌率小于40%表示抑菌效果不明显，所述相对抑菌率不小于40%且不超过80%表示具有一定的抑菌效果，所述相对抑菌率不小于80%表示抑菌效果极好。因此，化妆品原料受试物针对痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌的赋分之和＞0.5分表明至少化妆品原料受试物至少针对痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌中的一种表现出极好的抑菌效果，或者针对痤疮丙酸杆菌和金黄色葡萄球菌均表现出一定的抑菌效果。

20、优选的，所述步骤s2包括：

21、步骤s21：挑取稳定培养后的痤疮丙酸杆菌菌落于培养基中并添加质量百分比为2-5wt%皮脂混合物，于37℃、220r/min振荡厌氧培养3-7天后使用离心机后收集上清液，使用0.22μm滤膜过滤得到痤疮丙酸杆菌培养液，于-80℃冰箱储存；

22、步骤s22：培养hacat细胞并收集细胞形态良好，处于对数生长期的hacat细胞，用完全培养基培养后接种于96孔细胞培养板，除去原培养基，加入新鲜完全培养基配置的浓度梯度化妆品原料受试物；使用cck8法筛选得到hacat细胞存活率为90%时对应的化妆品原料受试物给药浓度，取对数生长期的hacat细胞接种于12孔细胞培养板培养，设置空白对照组、诱导模型组、阳性对照组及样品组，使用质量百分比为5%的所述步骤s21中制备的痤疮丙酸杆菌培养液造模并在各组中加入预设浓度的化妆品原料受试物培养16h~24h，后分别收集细胞rna检测相关基因tlr-2、tlr-4、il-8、tslp的表达水平；

23、步骤s23：计算步骤s22中各组别相关基因表达结果，应用graphpad prism作图，各组与诱导模型组比较采用one-way anova统计分析：针对每个基因当p<0.05且抑制率≥15%时说明与诱导模型组相比具有显著的抑制作用；当一个化妆品原料受试物在该模型中至少有1个基因具有抑制作用，则t2为1分。

24、优选的，所述步骤s3包括：

25、步骤s31：培养sz95细胞并收集细胞形态良好，处于对数生长期的sz95细胞，用完全培养基培养后接种于96孔细胞培养板，除去原培养基，加入新鲜完全培养基配置的浓度梯度化妆品原料受试物；使用cck8法筛选得到sz95细胞存活率为90%时对应的化妆品原料受试物给药浓度；取对数生长期sz95细胞接种于24孔细胞培养板，设置空白对照组、诱导模型组、阳性对照组及样品组，以二氢睾酮dht为诱导物，其余组别添加预设浓度的化妆品原料受试物培养16h~24h，后使用尼罗红染色法检测各组别脂滴分泌水平；

26、步骤s32：使用image j统计步骤s31中各组别脂滴分泌水平，应用graphpad prism作图，各组与诱导模型组比较采用one-way anova统计分析：当p<0.05且抑制率≥10%时则认为该化妆品原料受试物具有显著抑制脂滴分泌作用，则t3为1分。

27、优选的，所述步骤s4包括：

28、步骤s41：培养raw264.7细胞并收集细胞形态良好，处于对数生长期的raw264.7细胞，用完全培养基培养后接种于96孔细胞培养板，除去原培养基，加入新鲜完全培养基配置的浓度梯度化妆品原料受试物；使用cck8法筛选得到raw264.7细胞存活率为90%时对应的受试物给药浓度；取对数生长期的raw264.7细胞接种于24孔细胞培养板培养，设置空白对照组、诱导模型组、阳性对照组及样品组，使用脂多糖lps造模并在各组中加入预设浓度的化妆品原料受试物培养18h~24h，收集细胞上清液，elisa检测no基因、il-6基因、tnf-α基因的蛋白表达水平；

29、步骤s42：计算步骤s41中各组别no基因、il-6基因、tnf-α基因表达结果，应用graphpad prism作图，各组与诱导模型组比较采用one-way anova统计分析：当p<0.05且抑制率≥10%时则认为该化妆品原料受试物对no基因、il-6基因、tnf-α基因表达具有抑制作用，赋0.3分，当化妆品原料受试物在该模型中总赋分＞0.5分时则化妆品原料受试物在体外巨噬细胞抗炎舒缓模型中得1.0分，则t4为1分。

30、优选的，所述化妆品原料包括化学制品、生物制品、植物提取物中的一种或多种。

31、需要说明的是，所述化妆品原料可以通过化学反应合成得到，也可以通过生物反应得到，也可以自植物中提取得到。

32、优选的，所述化妆品原料受试物可均匀溶于培养基，且使用二甲基亚砜或乙醇作为溶剂时，溶剂的体积百分比浓度不得超过完全培养基总体积的0.5%，且阳性对照组和样品组中溶剂的体积比例相同。

33、优选的，步骤s13中所述菌悬液加入量为（1.0-2.0）×106cfu/ml；步骤s22中hacat细胞以（1.0-4.0）×104cell/ml密度接种于96孔细胞培养板中，以（2.0-5.0）×105cell/ml密度接种于12孔细胞培养板中；步骤s31中sz95细胞以1.0×104cell/ml密度接种于96孔细胞培养板，以（5.0-8.0）×104cell/ml密度接种于24孔细胞培养板；步骤s41中raw264.7细胞以1.0×104cell/ml密度接种于96孔细胞培养板，以（2.0-5.0）×105cell/ml密度接种于24孔细胞培养板。

34、优选的，步骤s12中的所述阳性对照组的试管由1至9号试管组成，所述阳性对照组中的阳性药为抗生素，所述抗生素为庆大霉素和克利霉素，8-9号试管不加抗生素；步骤s22中阳性对照组为浓度10~50μm的dex；s31中dht的终浓度为50~200μm，阳性对照组为浓度10~50μm的dex；s41中lps的终浓度为10~50μg/ml，阳性对照组为10~50μm的dex，每种化妆品原料受试物设3个及以上复孔。

35、优选的，步骤s31中脂滴分泌量采用尼罗红染色试剂盒；步骤s41中炎症因子no含量采用no检测试剂盒检测，炎症因子tnf-α、il-6含量采用elisa试剂盒检测。

36、优选的，步骤s1中所分析评价指标为对痤疮丙酸杆菌与金黄色葡萄球菌的抗菌效果；步骤s2中所分析评价指标为痤疮丙酸杆菌造模于角质细胞后tlr-2、tlr-4、il-8、tslp的相对表达量；步骤s3中所分析评价指标为皮脂腺细胞的相对控油率；步骤s4所分析评价指标为no、il-6、tnf-α的相对表达量；通过上述10个指标综合评价，最终得出所测受试物的总分t，当t≥0.5分时说该样品具有抗痤疮功效；同时能够通过受试物总得分的排序对多个化妆品原料体外抗痤疮功效进行比较。

37、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

38、本发明的一种化妆品原料体外抗痤疮功效评估组合方法，包含四种体外模型，覆盖了痤疮发生过程中多个关键节点，构建化妆品原料的抗痤疮功效体外评价方法，具有全面、高效、廉价的优势。为抗痤疮原料的初筛提供数据支持，也为护肤品行业动物替代实验、皮肤护理产品开发和功效验证的进一步研究提供有效依据。