快速可视化检测SADS-CoV的crRNA、试剂盒及方法

快速可视化检测sads-cov的crrna、试剂盒及方法
技术领域
1.本发明属于病原检测技术领域，涉及基于crispr-cas12a系统快速可视化检测sads-cov的crrna、试剂盒及方法。


背景技术：

2.猪急性腹泻综合征(swine acute diarrhea syndrome,sads)是由猪急性腹泻综合症冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,sads-cov)引起的一种高致病性的新型消化道传染性疾病，于2017年首次在我国发现。sads-cov主要感染5日龄以下的新生仔猪，可导致其急性腹泻、呕吐、脱水，最终死亡，死亡率达90％，给我国养猪业的稳定发展造成了重大威胁。另外，有报道称sads-cov还能感染其它哺乳动物来源的细胞系，包括人源细胞系，具有很高的跨物种传播风险，甚至可能危害人类生命健康。
3.疫病发生后，建立一种高效快捷灵敏的检测方法来对病毒进行快速诊断，可以及时阻止疫情的持续传播，对疫情防控有非常重要的意义。当前针对sads-cov的检测方法主要包括elisa、rt-lamp以及基于taqman、sybr green的rt-pcr等方法，这些方法均需要专业人员和特定设备，检测周期长、成本高，对于基层养殖场检测存在一定的局限性。因此，需要开发一种便捷的检测方法，以简单、快速、灵敏、特异地获得病毒的检测结果。
4.目前基于crispr-cas12a系统开发的分子诊断技术已经被广泛应用于新冠病毒、非洲猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、人腺病毒等多种病毒核酸的检测，该系统只需要恒温条件即可实现病毒核酸的快速可视化检测。但还没有将crispr-cas12a系统应用于检测sads-cov的。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一在于提供基于crispr-cas12a系统快速可视化检测sads-cov的crrna，特异性好。
6.本发明的目的之二在于提供含有上述crrna的试剂盒。
7.本发明的目的之三在于提供利用上述试剂盒快速可视化检测sads-cov的方法，可以从猪腹泻相关的系列冠状病毒中精准地检测出sads-cov，灵敏度高可达到单个拷贝级别，检测速率高且能实现可视化。
8.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明提供一种基于crispr-cas12a系统快速可视化检测sads-cov的crrna，所述crrna的序列如seq id no.10所示。
9.本发明还提供含有上述crrna的试剂盒，所述试剂盒中还包含rpa反应引物对、特异性引导rna、荧光淬灭报告探针。
10.在一个优选地技术方案中，所述rpa反应引物对的上游引物序列如seq id no.2所示、下游引物序列如seq id no.6所示，所述特异性引导rna的序列如seq id no.9所示，所述荧光淬灭报告探针的序列为fam-ttatt-bhq1。
11.本发明还提供上述试剂盒在快速可视化检测sads-cov中的应用。
12.在一个优选地技术方案中，所述快速可视化检测sads-cov是从sads-cov、pedv、tgev和pdcov四种病毒中快速检测出sads-cov病毒。
13.本发明还提供利用上述试剂盒快速可视化检测sads-cov的方法，包括以下步骤：以sads-cov cdna、pedv cdna、tgev cdna、pdcov cdna、h2o为模板，用rpa反应引物对进行rpa反应，利用特异性引导rna、crrna和荧光淬灭报告探针对rpa反应产物进行cas12a可视化酶切反应。
14.相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明选择sads-cov n基因序列上的相对保守区域，在保守序列中设计了rpa扩增需要的引物和探针，设计了cas12a蛋白酶切需要的crrna，设计了荧光报告系统的ssdna探针，通过实验条件的筛选和优化，使该方法检测灵敏度高可以达到单个拷贝级别，检测特异性好，可以从猪腹泻相关病毒中(sads-cov、pedv、tgev和pdcov)精准地检测出sads-cov，检测结果可以在蓝光照射下很方便地判读结果，实现检测结果可视化，有助于在生产饲养一线的养殖人员进行现场快速检测，从而严格控制prrsv的传播，具有重要的经济效益与社会价值。
附图说明
15.图1为本发明16对rpa引物敏感性测试结果图。
16.图2为sads-cov n基因crrna反应活性测试结果。
17.图3为ssdna-reporter敏感特异性检测结果图。
18.图4为本发明方法特异性检测结果图。
19.图5为本发明方法灵敏性检测结果图。
具体实施方式
20.以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
21.以下实施例中所用的sads-cov为sads-cov gds04毒株(genbank登录号：mf167434.1)，猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)为pedv cv777毒株(genbank登录号：af353511.1)，猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus，tgev)为tgev hlj-17毒株(genbank登录号：mt522161.1)，猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus，pdcov)为pdcov hnzk-02毒株(genbank登录号：mh708123.1)。
22.实施例一(1)sads-cov rna的提取(trizol法)
①
收取sads-cov病毒上清500μl，加入500μl trizol和0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，常温放置3-5min，于4℃，12000g离心15min，离心后分为3层，rna存在于最上层的水相中；
②
将上层水相转移至一新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min，于4℃，12000g离心10min；
③
弃上清，加入500μl75％乙醇，重悬洗涤rna沉淀，于4℃，12000g离心5min，弃上清，注意不要倒出沉淀，管中剩余的少量液体短暂离心，用枪头吸出；
④
将离心管室温放置晾干，加入50μl rnase-free ddh2o，反复吹打、混匀，充分溶解rna。
23.(2)sads-cov rna反转录表1 sads-cov rna反转录体系之后将反转录cdna稀释10倍使用。
24.(3)sads-cov n基因rpa引物筛选选择sads-cov n基因序列上的相对保守区域，在保守序列中设计了4对rpa引物：sads-cov-n-f1/r1(序列分别如seq id no.1和seq id no.5所示)、sads-cov-n-f2/r2(序列分别如seq id no.2和seq id no.6所示)、sads-cov-n-f3/r3(序列分别如seq id no.3和seq id no.7所示)、sads-cov-n-f4/r4(序列分别如seq id no.4和seq id no.8所示)，4对引物可以形成16对引物组合，如表2所示。
25.表2 16对引物组合rpa反应体系如下(每对引物进行2次重复)如表3所示。
26.表3 rpa反应体系
rpa反应程序如表4所示。
27.表4 rpa反应程序rpa检测所需的探针为probe-sads-cov-n，其序列为cagtttgggtttcaattaccaccagacc(fam-dt)g(thf)c(bhq1-dt)gttgttgaggtta-c3-spacer)。rpa反应结果如图1所示。由图1可知，sads-cov-n-f2/r2引物组合反应最为灵敏，后续均用该引物组合进行实验。
28.(4)sads-cov n基因crrna测试设计cas12a蛋白发生酶切反应的特异性引导rna：sads-cov-n-sgrna(序列如seq id no.9所示)。利用设计的sads-cov-n-sgrna，通过体外转录制备了用于crispr-cas12a系统检测sads-cov核酸的crrna分子：sads-cov-n-crrna(序列如seq id no.10所示)。
29.以sads-cov cdna为模板，用sads-cov-n-f2/r2引物进行pcr扩增反应，对pcr扩增产物进行胶回收，取200ng进行cas12a酶切，酶切体系如表5所示。
30.表5酶切体系37℃酶切30分钟，将产物进行电泳，结果如图2所示，图中 crrna代表酶切体系中添加crrna和cas12a的实验组，-crrna代表酶切体系中不添加crrna和cas12a的对照组。由图2可知，pcr产物酶切充分，说明本发明设计的crrna反应活性好。
31.(5)ssdna reporter筛选设计3条单链荧光猝灭报告探针ssdna-reporter1～ssdna-reporter3，其中ssdna-reporter1序列为fam-ttatt-bhq1，ssdna-reporter2序列为fam-ccacgggaggaataccaacccagtg-tamra，ssdna-reporter3序列为fam-tcctttgcacgccgtgggac-tamra。探针的荧光基团为fam，猝灭基团bhq1或tamra，在cas12a蛋
白发生酶切反应时单链报告探针会发生非特异性切割，使猝灭基团断裂，荧光基团发出荧光。以sads-cov cdna为模板，用sads-cov-n-f2/r2引物进行rpa反应，对rpa产物进行cas12a可视化酶切反应，酶切反应体系如表6所示。
32.表6 cas12a可视化酶切反应体系cas12a可视化酶切反应体系37℃酶切60分钟，将产物在紫外灯下拍照观察，ssdna-reporter敏感特异性检测结果如图3所示，图中ssdna-1反应管代表酶切反应体系中所用的ssdna为ssdna-reporter1，rpa反应模板为sads-cov cdna；ssdna-1-nc反应管代表酶切反应体系中所用的ssdna为ssdna-reporter1，rpa反应模板为水；ssdna-2反应管代表酶切反应体系中所用的ssdna为ssdna-reporter2，rpa反应模板为sads-cov cdna；ssdna-2-nc反应管代表酶切反应体系中所用的ssdna为ssdna-reporter2，rpa反应模板为水；ssdna-3反应管代表酶切反应体系中所用的ssdna为ssdna-reporter3，rpa反应模板为sads-cov cdna；ssdna-3-nc反应管代表酶切反应体系中所用的ssdna为ssdna-reporter3，rpa反应模板为水。
33.由图3可知，ssdna-reporter1反应特异性最强，其nc管没有颜色，ssdna-reporter2和ssdna-reporter3这两个探针与rpa试剂可以产生本底颜色，其nc管有颜色，所以选择ssdna-reporter1进行后续实验。
34.(6)系统特异性测试以sads-cov gds04毒株cdna，pedv cdna，tgev cdna，pdcov cdna，h2o为模板，用sads-cov-n-f2/r2引物进行rpa反应，反应体系如表7所示。
35.表7特异性测试反应体系39℃恒温反应20分钟后对rpa产物进行cas12a可视化酶切反应，酶切反应体系如表8所示。
36.表8可视化酶切反应体系
37℃酶切60分钟，将产物在紫外灯下拍照观察，结果如图4所示，图中sads-cov、pedv、tgev和pdcov分别代表反应管中添加的模板为sads-cov cdna、pedv cdna、tgev cdna和pdcov cdna，nc代表反应管中添加的模板为h2o。由图4可知，只有sads-cov反应管有颜色，其余均没有颜色，说明该系统特异性好。
37.(7)系统敏感性测试
①
sads-cov-n rna标准品制备以sads-cov cdna为模板，用sads-cov-n-in-vitro-f/r引物(序列如seq id no.11和seq id no.12所示)进行pcr扩增，对pcr扩增产物进行胶回收，得到sads-cov-n的体外转录模板，对其进行体外转录，得到sads-cov-n rna标准品。
38.②
sads-cov-n rna标准品稀释将sads-cov-n rna标准品进行梯度稀释，分别稀释至2
×
106、2
×
105、2
×
104、2
×
103、2
×
102、2
×
101、2
×
100。
39.③
sads-cov-n rna标准品反转录以上述稀释至不同拷贝数的sads-cov-n rna标准品为模板，进行反转录，反应体系如表9所示。
40.表9敏感性测试反转录反应体系37℃15分钟进行发转录反应，85℃5s秒钟进行反转录酶失活。
41.④
sads-cov-n cdnarpa反应及cas12a可视化酶切反应以反转录产物为模板，用sads-cov-n-f2/r2引物进行rpa反应，反应体系如表10所示。
42.表10敏感性测试rpa反应体系表10敏感性测试rpa反应体系
39℃恒温反应20分钟后对rpa产物进行cas12a可视化酶切反应，酶切反应体系如表11所示。
43.表11敏感性测试酶切反应体系37℃酶切60分钟，将产物在紫外灯下拍照观察，结果如图5所示，图中4
×
106、4
×
105、4
×
104、4
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103、4
×
102、4
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101和4
×
100分别代表反应体系中添加的sads-cov-nrna的拷贝数，nc代表反应管中添加的模板为h2o。由图5可知，nc反应管没有颜色，其余均没颜色，该系统可以检测到拷贝数低至4的sads-cov，说明该系统敏感性好。
44.以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。