糖尿病动物模型及其构建方法和应用与流程

本公开涉及人类疾病的动物模型。更具体地，本公开涉及糖尿病的非人类动物模型，及其构建方法和应用。

背景技术：

1、近年来，早发型2型糖尿病在世界范围内的发病率迅速上升，胰岛素分泌受损是其特征性表现，尤其是在亚洲地区，但其致病基因尚不清楚。胰岛β细胞中编码转录因子的基因被推测在2型糖尿病的发生发展中起关键作用，因为这些转录因子在胰腺分化、发育和β细胞功能中形成了一个复杂的调控网络，涉及胰岛糖代谢相关基因和胰岛素基因的表达。事实上，β细胞转录因子调控网络中关键基因的突变已经成为单基因糖尿病的致病原因。例如，青少年的成人起病型糖尿病(mody)即为一种常染色体显性遗传的、单基因、早发性2型糖尿病。

2、糖尿病精确诊断的关键驱动因素是遗传病因强烈影响治疗选择和临床病程。因此，鉴定常染色体显性遗传家族性2型糖尿病的遗传原因并研究其潜在的发病机制可能有助于理解血糖调节，从而为胰腺发育、功能和胰岛素转录调节提供新的生物学见解，以及为糖尿病提供潜在的新的治疗靶点。

技术实现思路

1、本公开涵盖了，对(非人类)动物进行基因工程化改造，以提供糖尿病的动物模型。该动物模型能够用于筛选和开发用于预防和/或治疗糖尿病的新药物和新的疗法。在一些实施方式中，所述动物模型包含isl-1基因中的突变，使得编码的isl-1蛋白具有一个或多个点突变。

2、根据本公开的一个方面，提供了一种糖尿病动物模型，其基因组中的胰岛素增强子结合蛋白-1(isl-1)基因包含外显子中的突变，并且编码与野生型isl-1多肽相比具有至少一个氨基酸置换的isl-1多肽。

3、在一些实施方式中，所述isl-1基因包含在外显子5中的一个或多个点突变。在一些实施方式中，所述isl-1基因编码的多肽在第283位具有氨基酸置换。在一些实施方式中，所述isl-1基因的编码蛋白的第283位的谷氨酸(glu，e)可以被置换成非e的其他氨基酸残基。在具体的实施方式中，所述isl-1基因编码的多肽第283位的谷氨酸(glu，e)可以被置换成天冬氨酸(asp，d)，即e283d。在一些实施方式中，所述动物可以表达包含e283d置换的isl-1多肽。

4、在一些实施方式中，所述动物为非人类动物。在一些实施方式中，所述动物可以为哺乳动物。在一些实施方式中，所述非人类哺乳动物可以为灵长类动物、兔、山羊、绵羊、猪、狗、奶牛或啮齿动物。在一些实施方式中，所述非人类动物可以为啮齿动物，例如大鼠、仓鼠或小鼠。

5、在一些实施方式中，对于所述isl-1基因的突变，所述动物可以为纯和的。在一些实施方式中，对于所述isl-1基因的突变，所述动物可以为杂合的。

6、在一些实施方式中，所述动物模型表现出糖尿病的一种或多种症状。在一些实施方式中，与野生型动物相比，所述动物模型表现出血糖水平升高、胰岛素表达水平下降和/或胰岛素分泌水平下降的症状。

7、根据另一方面，提供了一种非人类动物的组织或细胞，其来源于本公开的动物模型。

8、根据又一方面，提供了一种永生化细胞，所述永生化细胞由本公开的动物模型的细胞制备得到。

9、根据又一方面，提供了一种非人类动物的胚胎干(es)细胞，所述es细胞的基因组包含：isl-1基因的外显子中包含一个或多个点突变，并且编码与野生型isl-1多肽相比具有至少一个氨基酸置换。

10、在一些实施方式中，所述isl-1基因包含在外显子5中的一个或多个点突变。在一些实施方式中，所述isl-1基因编码的多肽在第283位具有氨基酸置换。在一些实施方式中，所述isl-1基因的编码蛋白的第283位的谷氨酸(glu，e)可以被置换成非e的其他氨基酸残基。在具体的实施方式中，所述isl-1基因编码的多肽第283位的谷氨酸(glu，e)可以被置换成天冬氨酸(asp，d)，即e283d。在一些实施方式中，所述es细胞可以表达包含e283d置换的isl-1多肽。

11、在一些实施方式中，所述es细胞的isl-1基因座还包含一个或多个选择性标记。在一些实施方式中，所述选择性标记可以为选自，但并不限于新霉素磷酸转移酶(neo)、潮霉素b磷酸转移酶(hph)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶(gpt)、次黄嘌呤磷酸转移酶(hprt)、胸腺嘧啶激酶(tk)及嘌呤霉素乙酰转移酶(puro)中的一种或多种。在一些实施方式中，插入的核酸包含一个或多个选择性标记可以使得易于对转染的es细胞进行选择。在一些实施方式中，经工程化改造的isl-1基因还包含一个或多个位点特异性重组酶识别位点。在一些实施方式中，经工程化改造的isl-1基因还包含重组酶基因和侧接有一个或多个位点特异性重组酶识别位点的选择性标记，所述位点特异性重组酶识别位点被定向为引导切除。

12、在一些实施方式中，一个或多个位点特异性重组酶识别位点包括loxp、lox511、lox2272、lox2372、lox66、lox71、loxm2、lox5171、frt、frt11、frt71、attp、att、frt、dre、rox或它们的组合。在一些实施方式中，重组酶基因选自cre、flp(例如，flpe、flpo)和dre。在某些实施方式中，一个或多个位点特异性重组酶识别位点是lox(例如，loxp)位点，并且重组酶基因编码cre重组酶。

13、在一些实施方式中，所述动物模型中不含有选择性标记。

14、根据本公开的又一方面，提供了一种非人类动物胚胎，其从本公开的es细胞产生。

15、根据本公开的又一方面，提供了一种制备经修饰的非人类动物的方法，所述方法包括修饰所述非人类动物的基因组，以使得经修饰的基因组的胰岛素增强子结合蛋白-1(isl-1)基因在外显子中包含一个或多个点突变，并且编码与野生型isl-1多肽相比具有至少一个氨基酸置换的isl-1多肽。

16、在一些实施方式中，所述修饰包括：将核酸序列引入所述非人类动物的es细胞的基因组中，以获得经修饰的es细胞，所述经修饰的es细胞的胰岛素增强子结合蛋白-1(isl-1)基因在外显子中包含一个或多个点突变，并且编码与野生型isl-1多肽相比具有至少一个氨基酸置换的isl-1多肽；和，使用所述经修饰的es细胞来产生所述非人类动物。

17、在一些实施方式中，所述非人类动物isl-1基因的外显子5包含一个或多个突变，编码与野生型isl-1多肽相比具有至少一个氨基酸置换的isl-1多肽。在一些实施方式中，所述非人类动物isl-1基因的外显子5包含一个或多个突变，编码与野生型isl-1多肽相比具有e283d氨基酸置换的isl-1多肽。

18、在一些实施方式中，所述将核酸序列引入所述非人类动物的es细胞的基因组中的步骤包括：(1)制备第一载体，其包括第一5’端同源臂和第一3’端同源臂；(2)利用所述第一载体，通过同源重组，在所述第一5’端同源臂和所述第一3’端同源臂之间插入isl-1基因对应于所述第一5’端同源臂和所述第一3’端同源臂之间的基因序列，得到第二载体；和(3)通过同源重组，在所述第二载体的所述第一5’端同源臂和所述第一3’端同源臂之间的片段置换成含所述突变的片段，得到打靶载体。

19、在一些实施方式中，所述第一5’端同源臂可以包括与isl-1基因座处的核苷酸同源的5’核苷酸序列。在一些实施方式中，所述第一5’端同源臂可以包括isl-1基因的5’utr、外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、内含子1、内含子2、内含子3和/或内含子4中的一个片段。在一些实施方式中，所述第一5’端同源臂可以包括isl-1基因的外显子3的一个片段。在一些实施方式中，所述第一5’端同源臂可以具有seq id no:38所示的核苷酸序列或与其具有至少85％序列一致性的核苷酸序列。

20、在一些实施方式中，所述第一3’端同源臂可以包括与isl-1基因座处的核苷酸同源的3’核苷酸序列。在一些实施方式中，所述第一3’端同源臂可以包括isl-1基因的内含子5、外显子6和/或3’utr中的一个片段。在一些实施方式中，所述第一3’端同源臂可以包括isl-1基因3’utr的一个片段。在一些实施方式中，所述第一3’端同源臂可以具有seq idno:39所示的核苷酸序列或与其具有至少85％序列一致性的核苷酸序列。

21、在一些实施方式中，步骤(3)中含所述突变的片段包括第二5’端同源臂和第二3’端同源臂。

22、在一些实施方式中，在所述打靶载体中，在所述第一5’端同源臂和所述第一3’端同源臂之间包含一个或多个选择性标记。在一些实施方式中，所述一个或多个选择性标记可以位于所述第二5’端同源臂和所述第二3’端同源臂之间。在一些实施方式中，步骤(3)中含所述突变的片段包括第二5’端同源臂、一个或多个选择性标记和第二3’端同源臂。

23、在一些实施方式中，所述第二5’端同源臂可以包括外显子5和/或内含子5中的一个片段。在一些实施方式中，所述第二5’端同源臂可以包括所述突变。在一些实施方式中，所述第二5’端同源臂可以具有seq id no:40所示的核苷酸序列或与其具有至少85％序列一致性的核苷酸序列。

24、在一些实施方式中，所述第二3’端同源臂可以包括内含子5中的一个片段。在一些实施方式中，所述第二3’端同源臂可以具有seq id no:41所示的核苷酸序列或与其具有至少85％序列一致性的核苷酸序列。

25、在一些实施方式中，所述第一5’端同源臂可以利用以下引物对，通过pcr获得：

26、上游引物：5’-aagtgcagcataggcttcagcaaga-3’(seq id no:46)；和

27、下游引物：5’-caggccactttctgcaccactgtgt-3’(seq id no:47)。

28、在一些实施方式中，所述第一3’端同源臂可以利用以下引物对，通过pcr获得：

29、上游引物：5’-attgcaacaaggttacctctatttt-3’(seq id no:48)；和

30、下游引物：5’-aaaaaagacaaaacacataaactta-3’(seq id no:49)。

31、在一些实施方式中，所述第二5’端同源臂可以利用以下引物对，通过pcr获得：isl-1-c1：

32、上游引物：5’-acttgggtatatttacttagcacat-3’(seq id no:50)；

33、下游引物：5’-atcccggtaccctccctcaccccag-3’(seq id no:51)。

34、在一些实施方式中，所述第二3’端同源臂可以利用以下引物对，通过pcr获得：

35、上游引物：5’-agagaaagcaggatgtggtggtgaa-3’(seq id no:52)；

36、下游引物：5’-cacagaactacttaggcactgagaa-3’(seq id no:53)。

37、在一些实施方式中，本公开的动物模型、细胞、组织或者es胚胎干细胞可以通过以下引物对进行鉴定：

38、上游引物：5′-atgccggggccggttcattcaggtt-3′(seq id no:42)；和

39、下游引物：5′-ctgagcccagaaagcgaagga-3′(seq id no:43)。

40、在一些实施方式中，本公开的动物模型、细胞、组织或者es胚胎干细胞还可以通过以下引物对进行鉴定：

41、上游引物：5′-cctcccccgtgccttccttgac-3′(seq id no:44)；和

42、下游引物：5′-gagtttatgtttgacttgtgggtga-3′(seq id no:45)。

43、根据本公开的又一方面，提供了一种筛选或鉴定用于糖尿病的药物的方法，所述方法包括向本公开的动物模型、细胞、组织和/或es细胞施用药物。在一些实施方式中，所述方法包括进行一种或多种测定，以确定所述药物是否对糖尿病的一种或多种症状具有治疗效果。当所述药物具有治疗效果时，将所述药物鉴定为治疗药物。

44、根据本公开的又一方面，提供了本公开的动物模型、细胞、组织和/或es细胞在筛选或鉴定用于糖尿病的药物或疗法中的用途。

45、在一些实施方式中，所述糖尿病可以为i型糖尿病和/或ii型糖尿病。在一些实施方式中，所述糖尿病可以为青少年的成人起病型糖尿病(mody)。