一种小型鱼类昼夜节律行为高通量观测装置及观测方法

本发明涉及化学品环境风险评估和水质评价，具体涉及一种小型鱼类昼夜节律行为高通量观测装置及观测方法。

背景技术：

1、据报道，全球已登记生产和使用的化学品超过35万种[1]。海量化学品可在其生产、使用和废弃的全生命周期中逐渐释放到环境中。水体是化学品的良好溶剂，且其流动性强、连通性广、循环交互速率快，迅速导致全球水环境面临着严重的化学污染问题。进行化学品危害和水质风险评估是实现水污染控制的重要科学基础。当前研究已证明鱼类能够较为敏锐地感受到化学品及水质变化带来影响，并做出行为改变[2]。因此，鱼类行为测试被认为是风险评估的有效工具[3]。

2、昼夜节律行为是指生物体生理生化过程常以24h为周期发生的生物振荡，最为重要的昼夜节律即睡眠-觉醒节律。昼夜节律行为受到生物体和环境影响的共同调节，如研究报道双酚a能够抑制金鱼大脑和肝脏中核心昼夜节律基因per2和cry1的表达进而扰乱昼夜节律[4]。在医院及城市废水中检测到的神经药物可引起鱼类的昼夜节律发生异常改变[5,6]。可见昼夜节律对鱼类维持正常生理活动至关重要，其改变将可综合性影响鱼类觅食、躲避敌害和繁殖机会等，进而引发种群结构变化。因此，以昼夜节律为指标评价化学品危害和水质风险具有较高的生态意义。

3、当前对鱼类昼夜节律行为的关注度不高，相应的测试装置及方法较为缺乏。特别是在装置方面，虽然目前已有针对运行行为、捕食行为等高关注度鱼类行为的观察装置出现，但将其直接应用于鱼类昼夜节律行为的观测仍然存在较多缺陷。例如现有的其他行为观察装置例如鱼类勇敢和探索行为的实验装置往往都设计为单次观察仅允许进行一组或单个个体进行[7,8]。由于鱼类的昼夜节律行为周期通常为24h，并且鱼类进入装置后仍需进行一段时间的适应，所以，若将其直接应用化学品危害识别和水质评估过程，针对长周期的昼夜节律行为，对多个组别依次进行单次观测，则存在整体观测周期过长，效率过低的问题。特别是化学品危害识别和水质评估中过程要求在相同的观测环境下进行多组别/多个体同时测试与观察，以获得有说服力的结论，这对单次高通量观测的需求较高。此外，由于上述过程并非单次高通量观测，存在因观测环境例如观察装置内养殖水水质不一致引发鱼类异常行为而导致观测结果说服力不足的问题。若为了确保不同组之间观测环境一致，在每组观测前均向观察装置内装入相同的养殖水水质，这种方式存在操作步骤繁琐，效率低下的问题。

4、[1]gong y,yang d,barrett h,et al.building the environmental chemical-protein interaction network(ecpin):an exposome-wide strategy for bioactivechemical contaminant identification[j].environmental science&technology,2023,57(9):3486-95.

5、[2]张金松,黄毅,韩小波,等.鱼的行为变化在水质监测中的应用[j].给水排水,2013,49(07):166-70.

6、[3]fukuda s,kang i j,moroishi j,et al.the application of entropy fordetecting behavioral responses in japanese medaka(oryzias latipes)exposed todifferent toxicants[j].environmental toxicology,2010,25(5):446-55.

7、[4]choi j y,choe j r,lee t h,et al.effects of bisphenol a and lightconditions on the circadian rhythm of the goldfish carassius auratus[j].biological rhythm research,2018,49(4):502-14.

8、[5]wu m,liu s,hu l,et al.global transcriptomic analysis of zebrafishin response to embryonic exposure to three antidepressants,amitriptyline,fluoxetine and mianserin[j].aquatic toxicology,2017,192:274-83.

9、[6]郭瑞颖.三丁基锡对斑马鱼(danio rerio)昼夜节律的影响及机制研究[d]；海南师范大学,2024.

10、[7]张华庆,邱宁,刘海英,等.鱼类勇敢和探索行为的实验装置及测试方法,cn112753623b[p/ol].

11、[8]孙孟,冯德军,桂福坤,等.一种鱼类行为观察装置,cn110800651b[p/ol].

技术实现思路

1、发明目的：本发明的第一方面所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种小型鱼类昼夜节律行为高通量观测装置，通过单次观测实现对小型鱼类昼夜节律行为的高通量分析，以评估化学品的生态危害及水质风险，并能确保单次高通量观测的有效性，进而提高观测效率和确保观测结果的说服力。

2、为了解决上述技术问题，本发明公开了一种小型鱼类昼夜节律行为高通量观测装置，该高通量观测装置包括鱼类观察装置。所述鱼类观察装置包括进液管路、观察室、出液管路和储水净水池。所述观察室包括进水缓冲区、观察区和出水缓冲区，所述观察区的一端与所述进水缓冲区连通，所述观察区的另一端与所述出水缓冲区连通。所述观察区内设置有多个泳室，相邻两个所述泳室相互连通。所述进液管路连通所述储水净水池和所述进水缓冲区，所述出液管路连通所述出水缓冲区和所述储水净水池，形成水流循环回路。

3、具体地，所述观察室包括观察室主体、第一横向匀水分隔件、第二横向匀水分隔件、横向观察区分隔件以及纵向观察区分隔件，所述观察室主体为顶部开口的长方形水槽结构。所述第一横向匀水分隔件、所述观察室主体和所述第二横向匀水分隔件围合形成所述观察区。所述第一横向匀水分隔件连接所述观察室主体形成所述进水缓冲区。所述第二横向匀水分隔件连接所述观察室主体形成所述出水缓冲区。所述横向观察区分隔件以及所述纵向观察区分隔件分隔所述观察区形成所述多个泳室。

4、具体地，所述观察室包括第一连通孔、第二连通孔和第三连通孔，所述横向观察区分隔件以及所述纵向观察区分隔件均开设有若干所述第一连通孔，若干所述第一连通孔用于连通相邻两个泳室。所述第一横向匀水分隔件上开设有若干所述第二连通孔，若干所述第二连通孔用于连通所述进水缓冲区与所述观察区。所述第二横向匀水分隔件上均开设有若干第三连通孔，若干所述第三连通孔用于连通所述出水缓冲区和所述观察区。

5、具体地，所述观察室包括第一溢流狭缝和第二溢流狭缝，所述第一横向匀水分隔件开设有第一溢流狭缝，所述第二横向匀水分隔件上均开设有第二溢流狭缝。所述第一溢流狭缝和所述第二溢流狭缝所处的高度位置相同。

6、具体地，所述观察室包括进水口和出水口，所述进水口设置于所述进水缓冲区与所述第一横向匀水分隔件相对的侧壁。所述进液管路的出水端口与所述进水口连通，所述进液管路的进水端口伸入所述储水净水池的液面之下。所述出水口设置于所述出水缓冲区与所述第二横向匀水分隔件相对的侧壁，所述出液管路的进水端口与所述出水口连接，所述出液管路的出水端口用于导流至所述储水净水池内。所述进水口高于所述出水口。

7、进一步地，该鱼类观察装置还包括透明盖板，所述透明盖板盖合在所述观察室主体上，用于防止鱼类跳跃进入临近泳室，或跃出所述观察室主体。

8、具体地，所述储水净水池包括池体、过滤装置和第二抽水泵，所述过滤装置安装至所述池体内，所述过滤装置的流体出口与所述第二抽水泵的入口连通。所述第二抽水泵用于将所述池体内部的水流吸入所述过滤装置内进行过滤处理，以去除水体中的鱼类粪便与食物残渣。

9、具体地，该高通量观测装置包括第一抽水泵，所述第一抽水泵用于为所述进液管路内输送的液体提供动力。

10、进一步地，所述储水净水池还包括用于调节所述储水净水池内水温的加热棒和曝气装置，所述加热棒配备于所述池体的液面之下。所述曝气装置配备于所述池体的液面之下，用于给水体充氧。

11、本发明的第二方面公开了一种小型鱼类昼夜节律行为高通量观测方法，采用上述的小型鱼类昼夜节律行为高通量观测装置实施，其中，该高通量观测装置包括12个泳室，该高通量观测装置还包括计算机和摄像机，所述计算机安装有可进行动物运动轨迹追踪的分析软件。所述摄像机设置在该高通量观测装置中的鱼类观察装置正上方一定高度处。

12、该观测方法包括以下步骤：

13、步骤一、向该高通量观测装置的观察室及储水净水池内加入适当量的鱼类养殖水，使所述鱼类养殖水在水流循环回路中循环流动。对储水净水池的鱼类养殖水进行曝气，且控制所述鱼类养殖水维持在一定温度。

14、步骤二、在每种暴露组及对照组各观测3个平行实验的前提下，待该高通量观测装置进入稳定运行状态后，同时将对照组活体鱼类和3种暴露组活体鱼类放入该高通量观测装置中适应数小时，其中所述对照组活体鱼类是指正常养殖的活体鱼类，所述暴露组活体鱼类是指经过待测化学品或者废污水样品暴露后的活体鱼类。其中，所述暴露组是观测个体或单泳室群体。当所述暴露组为观测个体时，所述对照组为观测个体。当所述暴露组为单泳室群体时，所述对照组为单泳室群体。

15、步骤三、适应结束后，利用所述摄像机按预设的观察周期同时对观察区的12个泳室中活体鱼类的行为拍摄视频影像。所述预设的观察周期至少包括一个以24h为周期的持续不间断的昼夜。

16、步骤四、在获取视频影像后，采用可进行动物运动轨迹追踪的分析软件计算在自定义的极短时间间隔δt内的运动速度，其计算原理为，基于经图像分析所获取的鱼类从t时刻位置移动到t+δt时刻位置的空间距离s计算该时间间隔δt内的鱼类运动速度v，所述鱼类运动速度v的计算公式为：v＝s/δt。

17、步骤五、将整个观察周期内的鱼类运动速度v低于1.5cm/s，并持续5s以上的时间段定义为睡眠时间。基于整个观察周期内的鱼类运动速度v计算24h以上的昼夜周期中每小时内睡眠时间占比，并绘制昼夜周期中每小时内睡眠时间占比随时间的变化曲线。

18、有益效果：

19、(1)本发明公开的一种小型鱼类昼夜节律行为高通量观测装置与观测方法，为日趋严重的水污染健康危害识别提供了一种反映化学品与水质变化对鱼类所产生的综合性生理生化危害的测试靶点与方法。

20、(2)在本发明公开的一种小型鱼类昼夜节律行为高通量观测装置中，鱼类观察装置相比于其他非专门性行为学观察装置，通过设置多个泳室，提高了单次测试的分析通量，即实现单次高通量观测，该单次高通量观测适用于需进行多组别/多个体测试与观察的化学品危害识别和水质评估过程，能获得有说服力的结论。通过设置水流循环回路，可实现该高通量观测装置内水质的净化和水体的循环利用，避免由高通量观测带来的水质恶化引发鱼类出现非测试因子所致的异常行为干扰观测结果；通过将观察室分为进水缓冲区、观察区和出水缓冲区，观察区设置在进水缓冲区与出水缓冲区之间，泳室设置在观察区，通过使储水净水池内的养殖水先经进液管路流入进水缓冲区减小流速，经减速的养殖水再流入观察区的各泳室，而观察区内的养殖水则先流入出水缓冲区再经出液管路排回储水净水池，避免鱼类受到出水口涡流影响，从而确保观察区水体环境稳定，避免因水体环境扰动引发鱼类出现非测试因子所致的异常行为干扰观测结果，从而整体上确保单次高通量观测的结果的有效性。

21、(3)在本发明公开的一种小型鱼类昼夜节律行为高通量观测装置的一个实施例中，通过在储水净水池内设置用于调节储水净水池内水温的加热棒，通过加热棒控制水体温度。进一步的，通过在储水净水池内设置曝气装置，用于给水体充氧，营造鱼类生活所需的必要溶氧环境。

22、(4)在本发明公开的一种小型鱼类昼夜节律行为高通量观测装置的一个实施例中，鱼类观察装置增设了透明盖板，避免因鱼类跳跃导致测试失败。