一种干化-复水交替培养促进弗吉尼亚栎体胚萌发的方法与流程

本发明涉及植物组织培养，尤其涉及一种干化-复水交替培养促进弗吉尼亚栎体胚萌发的方法。

背景技术：

1、弗吉尼亚栎(quercus virginiana)属壳斗科(fagaceae)栎属(quercus)树种，原产美国，为常绿阔叶高大乔木，是美国东南沿海重要的海岸防护林树种。弗吉尼亚栎能够耐受高浓度盐雾和较高的土壤盐分，另外，弗吉尼亚栎对重金属也具有很强的耐受性，目前已广泛用于我国东南沿海海涂造林、平原绿化以及矿山植被恢复，是重要的生态树种。同时，弗吉尼亚栎木材(橡木)密度高，材质好，具有很高的经济价值；其果实富含淀粉，可以为鸟类和动物提供食物来源，对丰富生物多样性具有重要意义。因此，弗吉尼亚栎由于具有良好的抗逆性、经济价值以及多种用途，在长三角市场需求很大。

2、目前，弗吉尼亚栎苗木大多采用种子繁殖，然而由于实生苗变异大，导致苗木均一性差，影响其市场价值。虽然前期已经通过扦插和组织培养方法解决了弗吉尼亚栎的无性繁殖技术，但前期组织培养是基于带芽茎段建立的组培苗再生体系，仅仅解决了弗吉尼亚栎的无性扩繁。而随着对弗吉尼亚栎遗传改良的需求，弗吉尼亚栎遗传转化体系的构建也迫在眉睫，但当前并没有成熟的转化体系。在本领域，基于胚性愈伤组织的体胚发生及试管苗再生技术，是进行植物遗传转化的基础，未成熟合子胚虽然能够诱导胚性愈伤组织的产生，但体胚萌发率一直不高，甚至有的体胚不萌发，这严重制约了弗吉尼亚栎体胚再生途径的构建。

3、体胚干化处理被用于很多针叶树的体胚萌发促进，如体胚萌发之前进行适当的干化预处理，可以提高云杉、樟子松等树种体胚萌发率。然而由于干化处理影响的因素很多，由于干化处理方法、干化时间以及树种的不同，产生的效果也各不相同。

4、基于上述问题，希望能够找到一种专门促进弗吉尼亚栎体胚萌发的干化处理方法，提升体胚萌发率，有利于弗吉尼亚栎体胚再生途径的构建。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种促进弗吉尼亚栎体胚萌发的处理方法，提升体胚萌发率。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、一种干化-复水交替培养促进弗吉尼亚栎体胚萌发的方法，包括以下步骤：

4、(1)取弗吉尼亚栎的未成熟合子胚为外植体进行体胚诱导，获得胚性愈伤组织；

5、(2)将步骤(1)获得的胚性愈伤组织转入增殖培养基中进行暗培养，获得子叶胚；

6、(3)将步骤(2)获得的子叶胚进行干化-复水交替培养；

7、(4)将步骤(3)干化-复水交替处理过的子叶胚转入富含氨基酸的ms培养基中进行体胚萌发培养，得到弗吉尼亚栎试管苗。

8、优选的，步骤(1)中所述外植体的采集时间为每年的7月中旬至8月中下旬。

9、优选的，步骤(1)中所述体胚诱导为：将未成熟合子胚置于诱导培养基中，在ph5.6～5.8，23～25℃的条件下，暗培养28～31天。

10、优选的，所述诱导培养基的组成为：ms+水解酪蛋白200～500mg/l+谷氨酰胺0.1～1g/l+脯氨酸0.5～5mmol/l+0.044～0.44μm 6-ba。

11、优选的，步骤(2)中所述增殖培养基的组成为：ms+水解酪蛋白200～500mg/l+谷氨酰胺0.1～1g/l+脯氨酸0.5～5mmol/l。

12、优选的，步骤(3)中所述干化-复水交替培养为：将子叶胚干化处理3～7d，然后转入1/4ms低盐培养基中复水3～7d，所述干化处理和复水的培养环境均为暗培养，将复水后的子叶胚在光照环境下再次进行干化处理2～4d。

13、优选的，所述干化处理是利用双层培养皿自然干化、利用滤纸进行干化处理或利用化学试剂进行干化处理；所述化学试剂为饱和ca(no3)2·4h2o溶液。

14、优选的，所述富含氨基酸的ms培养基的组成为：ms+水解酪蛋白200～500mg/l+谷氨酰胺0.1～1g/l+脯氨酸0.5～5mmol/l。

15、优选的，所述1/4ms低盐培养基，是将所述富含氨基酸的ms培养基中的大量元素含量减至1/4，其他微量元素、有机物、铁盐、蔗糖和植物凝胶含量以及氨基酸含量不变。

16、优选的，所述体胚萌发的培养条件为：温度23～25℃，光暗周期为16h/8h，光照强度250～300μmol·m-2·s-1。

17、有益效果

18、本发明提供的一种干化-复水交替培养促进弗吉尼亚栎体胚萌发的方法对弗吉尼亚栎未成熟合子胚进行诱导和增殖培养之后，进行干化处理后转入不含激素的1/4ms培养基进行复水，然后再次进行干化处理，能够缩短弗吉尼亚栎体胚的萌发时间，提升萌发率。

19、试验结果表明，本发明干化-复水交替培养法的萌发率均有不同程度的提升，萌发时间也可大幅缩短。其中，化学试剂干化-复水处理的萌发时间相较于化学试剂干化处理的萌发时间缩短了36％，萌发率提升了7.3％。

技术特征：

1.一种干化-复水交替培养促进弗吉尼亚栎体胚萌发的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)中所述外植体的采集时间为每年的7月中旬至8月中下旬。

3.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)中所述体胚诱导为：将未成熟合子胚置于诱导培养基中，在ph 5.6～5.8，23～25℃的条件下，暗培养28～31天。

4.如权利要求3所述方法，其特征在于，所述诱导培养基的组成为：ms+水解酪蛋白200～500mg/l+谷氨酰胺0.1～1g/l+脯氨酸0.5～5mmol/l+0.044～0.44μm 6-ba。

5.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)中所述增殖培养基的组成为：ms+水解酪蛋白200～500mg/l+谷氨酰胺0.1～1g/l+脯氨酸0.5～5mmol/l。

6.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)中所述干化-复水交替培养为：将子叶胚干化处理3～7d，然后转入1/4ms低盐培养基中复水3～7d，所述干化处理和复水的培养环境均为暗培养，将复水后的子叶胚在光照环境下再次进行干化处理2～4d。

7.如权利要求6所述方法，其特征在于，所述干化处理是利用双层培养皿自然干化、利用滤纸进行干化处理或利用化学试剂进行干化处理；所述化学试剂为饱和ca(no3)2·4h2o溶液。

8.如权利要求7所述方法，其特征在于，所述富含氨基酸的ms培养基的组成为：ms+水解酪蛋白200～500mg/l+谷氨酰胺0.1～1g/l+脯氨酸0.5～5mmol/l。

9.如权利要求6所述方法，其特征在于，所述1/4ms低盐培养基，是将所述富含氨基酸的ms培养基中的大量元素含量减至1/4，其他微量元素、有机物、铁盐、蔗糖和植物凝胶含量以及氨基酸含量不变。

10.如权利要求9所述方法，其特征在于，所述体胚萌发的培养条件为：温度23～25℃，光暗周期为16h/8h，光照强度250～300μmol·m-2·s-1。

技术总结本发明提供了一种干化‑复水交替培养促进弗吉尼亚栎体胚萌发的方法，属于植物组织培养技术领域。包括以下步骤：(1)取弗吉尼亚栎的未成熟合子胚为外植体进行体胚诱导，获得胚性愈伤组织；(2)将步骤(1)获得的胚性愈伤组织转入增殖培养基中进行暗培养，获得子叶胚；(3)将子叶胚进行干化‑复水交替处理；(4)将步骤(3)干化‑复水交替处理过的子叶胚进行体胚萌发培养，得到弗吉尼亚栎试管苗。本发明在对弗吉尼亚栎未成熟合子胚进行诱导和增殖培养之后，进行干化‑复水交替培养，能够缩短弗吉尼亚栎体胚的萌发时间，提升萌发率。技术研发人员：王树凤,施翔,陈益泰,徐琴娣受保护的技术使用者：中国林业科学研究院亚热带林业研究所技术研发日：技术公布日：2024/6/13