一种具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶及其制备方法与应用

本发明涉及生物材料领域，特别涉及一种具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶及其制备方法与应用。

背景技术：

1、多次宫内手术、感染、内膜炎症等易引起内膜损伤、子宫肌层病变并形成顽固型薄型子宫内膜，导致不孕、反复胚胎种植失败、习惯性流产及妊娠并发症患病风险增加等。药物如雌激素、促性腺激素、来曲唑、枸橼酸西地那非、己酮可可碱、维生素e和他莫西芬等可一定程度上提高子宫内膜厚度和胚胎着床率，但药物副作用明显且疗效有限，无法有效促进中重度损伤子宫内膜再生或改善妊娠结局，内膜粘连复发率高。

2、炎症、活性氧、ph等微环境是影响子宫内膜修复的主要因素，而o2-、h2o2、oh-等ros上调导致内膜微环境中h2o2异常升高加剧炎症水平，导致内膜生理性修复无法正常完成，进而转向以纤维化为主的瘢痕修复。近年来，干细胞疗法和宫腔局部药物灌注已成为薄型子宫内膜治疗的研究热点。干细胞是一类具有自我更新和多向分化能力的细胞，在组织损伤修复过程中发挥旁分泌、免疫调节和促进再生修复等关键作用。局部注射可将干细胞直接输送至损伤部位，但细胞活力低、局部驻留时间短等问题极大的限制了其应用。prp灌注治疗因其能够提供超过生理量的必要生长因子，可为愈合潜力低的组织修复提供再生刺激的作用，但生长因子突释及超生理剂量引起的安全性问题逐渐受到重视。随着组织工程与再生医学的发展，利用生物材料递送干细胞、生物活性因子或药物用于子宫内膜损伤修复治疗取得了显著效果，开辟了生物材料与传统治疗相结合的子宫内膜损伤修复新途径。

3、水凝胶是一类具有良好生物相容性、吸水性和包封性的亲水三维高分子网络，可为子宫内膜修复提供物理抗粘连屏障，其类细胞外基质结构可作为理想的细胞递送载体和宫内控释给药体系，具有广阔的应用前景。针对重度宫腔粘连、子宫氧化微环境及内膜再生障碍等关键问题，亟需一种具备氧化微环境响应并可同时作为干细胞和生物活性因子缓释作用的多功能水凝胶产品解决上述问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶的制备方法。

2、本发明的另一目的在于，提供上述制备方法制备得到的具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶。

3、本发明的再一目的在于，提供上述水凝胶的应用。

4、本发明的目的通过下述技术方案实现：

5、一种具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶前驱液的制备方法，包括如下步骤：

6、(1)将壳聚糖溶于溶液，加入edac和nhs，避光搅拌，调节ph后反应，加入l-半胱氨酸后继续避光搅拌反应，透析，离心，干燥后得到巯基化壳聚糖(tchi)；

7、(2)将透明质酸钠搅拌溶于溶液，加入edac搅拌，加入nhs继续搅拌，调节ph后避光反应，之后加入半胱氨酸反应，调节ph后继续避光搅拌反应，透析，干燥后得到巯基化透明质酸(tha)；

8、(3)将巯基化壳聚糖、巯基化透明质酸和β-gp分别溶解得到溶液，在β-gp溶液中加入巯基化透明质酸溶液并同时快速涡旋，再加入巯基化壳聚糖溶液，再次快速涡旋，得到具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶前驱液。

9、优选的，所述的制备方法中的步骤(3)为：

10、(3)将巯基化壳聚糖、巯基化透明质酸和β-gp分别溶解得到溶液，在β-gp溶液中加入巯基化透明质酸溶液并同时快速涡旋，再加入巯基化壳聚糖溶液，再次快速涡旋，之后加入活性物质，快速涡旋混匀，即得到具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶前驱液。

11、步骤(1)所述的溶液为乙酸溶液；优选为1％乙酸溶液。

12、步骤(1)所述的溶液与壳聚糖的比例为300～500ml﹕1g；优选为400ml﹕1g。

13、步骤(1)所述的edac的加入量以终浓度20～30mm计；优选为25mm。

14、步骤(1)所述的nhs的加入量以终浓度20～30mm计；优选为25mm。

15、步骤(1)所述的半胱氨酸与壳聚糖的质量比为0.5～1﹕1；优选为0.66﹕1。

16、步骤(1)所述的避光搅拌的时间为30～90min。

17、步骤(1)所述的避光搅拌的条件为室温，800～1000rpm。

18、步骤(1)所述的调节ph为调节ph至4.5～5.5。

19、步骤(1)所述的第一次反应的条件为反应1～3h。

20、步骤(1)所述的第二次反应的条件为反应20～30h。

21、步骤(1)所述的透析为使用mw 3000～4000的透析袋在ph 3～4的去离子水中透析。

22、步骤(1)所述的离心为3000～5000rpm离心。

23、步骤(2)所述的溶液为去离子水。

24、步骤(2)所述的溶液与透明质酸钠的比例为100～300ml﹕1g；优选为200ml﹕0.8g。

25、步骤(2)所述的edac的加入量以终浓度20～30mm计；优选为25mm。

26、步骤(2)所述的nhs的加入量以终浓度20～30mm计；优选为25mm。

27、步骤(2)所述的半胱氨酸与透明质酸钠的质量比为0.5～1﹕1；优选为0.5﹕1。

28、步骤(2)所述的第一次搅拌的条件为搅拌1～2h。

29、步骤(2)所述的第二次搅拌的条件为搅拌10～20min。

30、步骤(2)所述的第三次搅拌的条件为搅拌30～90min。

31、步骤(2)所述的第一次调节ph为调节ph至5～6。

32、步骤(2)所述的第二次调节ph为调节ph至4～5。

33、步骤(2)所述的第一次反应的条件为反应1～3h。

34、步骤(2)所述的第二次反应的条件为反应30～90min。

35、步骤(2)所述的第三次反应的条件为反应20～30h。

36、步骤(2)所述的透析为使用mw 3000～4000的透析袋，分别用ph 3.5的去离子水透析一天，用ph 3.5的1％ nacl水溶液透析一天，用ph 3.5的去离子水透析一天。

37、步骤(3)所述的巯基化壳聚糖溶液为将巯基化壳聚糖溶于乙酸溶液得到的；优选为0.1m的乙酸溶液。

38、步骤(3)所述的巯基化壳聚糖溶液的浓度为15～30mg/ml。

39、步骤(3)所述的巯基化透明质酸溶液为将巯基化透明质酸溶于水得到的。

40、步骤(3)所述的巯基化透明质酸溶液的浓度为15～30mg/ml。

41、步骤(3)所述的β-gp溶液为将β-gp溶于水得到的。

42、步骤(3)所述的β-gp溶液中β-gp与溶液的质量体积比为0.5～1﹕1；优选为0.58﹕1。

43、步骤(3)所述的巯基化透明质酸溶液、巯基化壳聚糖溶液、58％β-gp的体积比为1～2﹕1～2﹕1～2；优选为2﹕1﹕1。

44、步骤(3)中所述的快速涡旋为使用漩涡混匀仪快速涡旋10～15s。

45、步骤(3)所述的活性物质为prp生长因子复合物和小鼠脂肪间充质干细胞(madscs)中的至少一种。

46、所述的prp生长因子复合物与凝胶前驱液的体积比为1﹕4～10。

47、所述的prp生长因子复合物的制备方法包括如下步骤：

48、小鼠外周血1000rpm离心10min后取上层清液、中间白膜层和下层3mm红细胞，继续3000rpm离心10min去除下层红细胞和上层的低浓度血小板血清，留取中间白膜层和少量红细胞，每毫升添加20u牛凝血酶，与10％ cacl2溶液按9:1体积混合，置于37℃培养箱中孵育40min，取出2000rpm离心10min，即得到prp生长因子复合物。

49、所述的小鼠脂肪间充质干细胞与凝胶前驱液的比例为400～1500个﹕1微升。

50、所述的小鼠脂肪间充质干细胞为细胞融合度70～90％的对数期小鼠脂肪间充质干细胞。

51、一种具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

52、(4)将具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶前驱液置于合适温度成胶后，即得到具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶。

53、步骤(4)中所述的成胶为置于35～40℃下成胶3～10min。

54、一种具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶或水凝胶前驱液，根据上述制备方法制备得到。

55、上述具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶或水凝胶前驱液在制备可递送活性物质的生物修复支架中的应用。

56、上述具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶或水凝胶前驱液在制备子宫内膜修复药物中的应用。

57、上述具有氧化还原敏感性和生物活性的水凝胶或水凝胶前驱液在制备治疗宫腔粘连药物中的应用。

58、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

59、(1)本发明的氧化还原敏感性生物活性水凝胶可实现干细胞有效递送和prp生长因子的局部控释，调节内膜微环境，防止小鼠子宫内膜粘连并加速损伤内膜的修复。采用经巯基改性修饰的天然生物大分子tchi和tha制备的水凝胶具有无免疫原性、可生物降解性和高生物活性等优点。prp激活后血小板可释放血小板衍生生长因子(platelet-derivedgrowth factor，pdgf)、表皮生长因子(epidermal growth factor，egf)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)等多种生长因子和分化因子，促进组织坏死消退和趋化、细胞再生、增殖和迁移、细胞外基质合成、重构和血管生成。但在生理条件下，生长因子的半衰期短，而本发明制备的水凝胶可作为prp来源的生长因子控释载体，通过体内透明质酸酶的酶解作用逐步降解水凝胶，从而实现生长因子的缓慢释放，有效延长pdgf、egf和vegf等prp来源生长因子的作用时间。

60、(2)水凝胶的类细胞外基质结构可作为干细胞的理想载体，为子宫内膜修复提供外源性干细胞以促进损伤修复，而生长因子的有效控释可进一步维持干细胞在体内的高活性水平，加速内膜再生。另外，该水凝胶的温度敏感性及自愈合特点使其在室温条件可注射并在生理温度下加速凝胶化，为子宫内膜提供物理隔离屏障，大大提高了临床可操作性；壳聚糖良好的生物相容性、粘附性和抗菌性能，有利于水凝胶在宫腔内膜附着并降低宫内再次感染风险；透明质酸具有吸收创面分泌物、促进间充质干细胞迁移和调节损伤部位炎症反应的作用；而水凝胶提供的巯基经体内自由基氧化脱氢形成二硫键，从而减轻氧化微环境对蛋白质巯基的氧化作用并维持蛋白巯基的功能状态，维持子宫内较低水平的炎症和氧化微环境，为组织再生创造有利条件，促进功能性子宫内膜再生并减少疤痕形成，进而增加胚胎着床率，恢复生育能力。

61、(3)与现有的临床上治疗宫腔粘连的商业化透明质酸钠水凝胶(g-ha)相比，本发明制备的生物活性水凝胶在动物实验中表现出更优异的促子宫内膜修复能力。综上所述，本发明的氧化还原敏感性生物活性水凝胶通过提供外源性干细胞、生长因子持续释放并主动调控子宫内膜微环境，从而为子宫内膜损伤修复创造有利条件，加速子宫内膜再生修复，防止子宫内膜纤维化，抑制子宫疤痕形成并提高胚胎着床率。