生产基因修饰的细胞的方法

发明领域本公开涉及使用基于成簇间隔规则短回文重复(crispr)的基因编辑系统将多种基因修饰引入细胞中而产生基因工程化细胞的新方法、细胞、系统、试剂盒和其他方面。

背景技术：

1、原代人类细胞的精确基因调节在治疗包括免疫治疗、自身免疫和酶病(enzymopathy)领域在内的人类疾病方面具有多种应用。例如，患者免疫细胞的基因调节是一种有吸引力的治疗途径，因为对免疫细胞所做的改变是永久性的，并且患者对此类细胞的排斥风险较低。免疫细胞基因编辑的一种方法是使用成簇规则间隔短回文重复(crispr)系统在目标基因内诱导双链断裂(dsb)，然后通过高效但易出错的非同源基因末端连接(nhej)途径或通过效率较低但高保真的同源定向修复(hdr)途径进行修复。nhej修复途径是最活跃的修复机制，经常导致dsb位点处出现小核苷酸插入或缺失(indel)，引起氨基酸缺失、插入或移码突变，从而导致靶基因开放阅读框(orf)内的提前终止密码子或无义突变。此外，在多重基因编辑过程中诱导多个dsb可能会导致不希望的基因毒性，并形成潜在的致癌性大范围染色体易位。通过使用修饰的核酸酶(例如cas9切口酶)可以实现更精确的基因编辑，该核酸酶仅保留一个活性核酸酶结构域并生成dna切口(nick)而不是平端化的dsb。变体cas9 d10a是spcas9的突变体，仅保留hnh核酸酶活性，并且在存在两个靶向相反dna链的引导rna(grna)的情况下，产生错位dsb(staggered dsb)，从而提高靶标特异性。

2、嵌合抗原受体-t(car-t)细胞免疫疗法是一种新方法，涉及对患者自身的t细胞进行基因修饰，以表达对肿瘤抗原特异的car。该方法是一种个体化治疗，涉及离体扩增基因修饰的细胞，然后重新输回患者体内。该疗法在血液系统癌症中显示出令人印象深刻的效果，抗cd19 car-t疗法已被批准用于治疗cd19阳性白血病或淋巴瘤(yescartatm、kymriahtm、tecartustm和breyanzitm)，并且抗bcmacar-t疗法已被批准用于治疗多发性骨髓瘤(abecmatm)。尽管在一些患者中取得了令人鼓舞的结果，但car-t的应用会引起许多急性副作用，例如细胞因子释放综合征和神经毒性，在某些情况下导致患者死亡。

3、长期安全性结果，例如免疫原性和对基因修饰的t细胞的生长和发育的不利影响，仍然是该疗法的一个问题。因此，需要开发改进的car-t细胞疗法，以减少对患者的副作用和健康风险。此外，考虑到与个性化方法相关的复杂性的水平(目前这是必要的要求)，需要开发“现成的”或同种异体的car-t细胞疗法，并解决与治疗时间、生产、质量和成本相关的问题。

4、通常使用随机整合载体将car转导至患者的t细胞中，这可能导致致癌转化、多样化的转基因表达和转录沉默。最近，基因组编辑的进步使得高效、靶向性的基因递送成为可能。将cd19特异性car引导至t细胞受体α恒定(trac)基因座可以使car的表达在内源性trac调节元件的控制下，从而增强t细胞效力并延缓耗竭。

技术实现思路

1、在第一方面，本公开提供了对细胞进行多个基因修饰的方法，该方法包括将以下引入细胞中和/或在细胞中表达以下：

2、a)用于将外源序列整合至第一靶核酸序列处的crispr系统，所述crispr系统包含：

3、i)与所述第一靶核酸序列的相对链互补的第一grna和第二grna；

4、和

5、ii)包含所述外源序列的供体核酸序列；

6、b)用于在第二靶核酸序列处引入基因修饰的碱基编辑系统，所述碱基编辑系统包含：

7、i)rna支架，其包含与第二靶核酸序列互补的引导rna序列和募集rna基序；和

8、ii)效应子融合蛋白，其包含能够与募集rna基序结合的rna结合结构域和包含碱基修饰酶的效应子结构域；和

9、c)rna引导的切口酶，其能够与所述crispr系统的第一和第二grna以及所述碱基编辑系统的rna支架相互作用；和

10、培养所述细胞，以产生包含多个基因修饰的细胞。

11、在任何实施方案中，因为rna引导的切口酶能够与crispr系统和碱基编辑系统的rna支架两者相互作用，所以所述方法可以仅使用一种rna引导的切口酶(本文也称为单rna引导的切口酶或共同rna引导切口酶)来进行。这可能是有利的，因为它减少了需要提供和递送至细胞的组分的数量。

12、在一些实施方案中，碱基修饰酶具有胞嘧啶脱氨活性、腺苷脱氨活性、dna甲基转移酶活性或去甲基酶活性。

13、在一些实施方案中，rna引导的切口酶可以是crispr ii型或v型酶。在一些实施方案中，当rna引导的切口酶是crispr ii型酶时，该酶是cas9切口酶。在一个实施方案中，rna引导的切口酶是具有一种或两种尿嘧啶糖基化酶抑制剂(ugi)的ncas9。

14、在一些实施方案中，第一和第二grna可以作为sgrna提供。

15、在一些实施方案中，本文的方法、细胞、系统和试剂盒中使用的rna支架可包含tracrrna。在crispr ii型系统中，前体crrna(pre-crrna)的成熟需要转录激活crispr(tracr)rna的参与。然而，在crispr v型系统中，尚未鉴定出tracrrna，并且pre-crrna加工是由v型效应子蛋白本身介导的。

16、在一些实施方案中，本文的方法、细胞、系统和试剂盒中使用的rna支架可以作为化学合成的rna引入细胞中并且可以包含一种或多种化学修饰。

17、在一些实施方案中，本文提供的方法、细胞、系统和试剂盒可以利用一个或多个募集rna基序，在一些实施方案中，所述募集rna基序位于rna支架的3'端。所述募集rna基序可以是ms2适配体(aptamer)，在一些实施方案中是具有延伸茎(例如包含2-24个核苷酸的延伸茎)的ms2适配体。

18、在一些实施方案中，本文提供的方法、细胞、系统和试剂盒可以使用具有胞嘧啶脱氨基活性或胞苷脱氨基活性(所述术语可互换使用)的效应子结构域，例如，aid、cda、apobec1、apobec3a、apobec3b、apobec3c、apobec3d、apobec3f或其他apobec家族酶的野生型或基因工程化版本。

19、在一些实施方案中，本文提供的方法、细胞、系统和试剂盒可以使用具有腺嘌呤脱氨活性或腺苷脱氨活性(所述术语可互换使用)的效应子结构域，例如ada、adar家族酶或trna腺苷脱氨酶的野生型或基因工程化版本。

20、在一些实施方案中，本文提供的方法、细胞、系统和试剂盒可以使用具有dna甲基转移酶活性的效应子结构域，例如dnmt1、dnmt3a或dnmt3b的野生型或基因工程化版本。

21、在一些实施方案中，本文提供的方法、细胞、系统和试剂盒可以使用具有去甲基酶活性的效应子结构域，例如tet1、tet2或tdg的野生型或基因工程化版本。

22、在一些实施方案中，本文提供的方法、细胞、系统和试剂盒可以使用与trac或b2m基因座的相对链互补的第一grna和第二grna。

23、在一些实施方案中，所述方法、细胞、系统和试剂盒可以使用包含多个碱基编辑系统的模块系统，所述多个碱基编辑系统能够结合不同的靶核酸序列以对多个不同的基因座进行基因修饰。

24、在一些实施方案中，本文方法中使用的crispr系统可以引入包含侧接对第一靶核酸序列特异的同源臂的car或tcr编码序列的供体核酸序列。在一些实施方案中，所述car或tcr编码序列被整合在trac或b2m基因座上。所述car或tcr编码序列的表达可由内源trac或b2m启动子驱动。

25、在一些实施方案中，编码所述crispr系统、碱基编辑系统和rna引导的切口酶中的每一个的核酸可以在单个转染步骤中被引入细胞中。在一些实施方案中，供体核酸序列可以使用病毒载体例如aav而引入细胞中。或者，供体核酸序列可以在单个转染步骤中被引入到细胞中。

26、在一些实施方案中，本文提供的方法、细胞、系统和试剂盒涉及引入一种或多种基因修饰的碱基编辑系统，所述基因修饰纠正基因突变、使基因表达失活、改变基因的表达水平或改变内含子-外显子剪接。在其他实施方案中，由所述碱基编辑系统引入的基因修饰可以是点突变，任选地，其中所述点突变引入提前终止密码子、破坏起始密码子、破坏剪接位点或纠正基因突变。在一些实施方案中，本文提供的方法中使用的引导rna序列可以包括剪接受体-剪接供体位点(a splice acceptor-splice donor site，sa-sd)序列。

27、在一些实施方案中，本文提供的方法、细胞、系统和试剂盒可以靶向细胞中的不同基因。例如，所述碱基编辑系统可以引入导致trac、trbc1、trbc2、pdcd1、cd52和b2m中的任一种或多种的表达降低的基因修饰。

28、在一些实施方案中，本文提供的方法、细胞、系统和试剂盒可用于提供同时发生的多个基因修饰。

29、在一些实施方案中，本文提供的方法可用于修饰任何细胞，特别是免疫细胞或人多能干细胞(hpsc)。免疫细胞可包括t细胞、自然杀伤(nk)细胞、b细胞、原粒细胞(myeloblast)、淋巴母细胞和cd34+造血干细胞和祖细胞(hspc)。

30、在具体实施方案中，所述免疫细胞是原代t细胞。

31、在具体实施方案中，所述细胞是诱导性多能干细胞(ipsc)。

32、在第二方面，本公开提供了通过本文描述的方法获得的基因修饰的细胞。在一些实施方案中，所述基因修饰的细胞在内源trac或b2m基因座中包含外源car或tcr编码序列以及在3个或更多个基因中包含至少一个点突变。在其他实施方案中，所述基因修饰的细胞在内源trac或b2m基因座中包含外源car或tcr编码序列以及在选自trac、trbc1、trbc2、pdcd1、cd52和b2m的3个或更多个基因中包含至少一个点突变，导致所述基因的功能性敲除。

33、在第三方面，本公开提供了通过本文描述的方法获得的同种异体t细胞。

34、在第四方面，本公开提供了用于对细胞进行基因修饰的系统，其包含i)crispr系统，ii)碱基编辑系统，和iii)rna引导的切口酶，或如本文所述编码i)、ii)和iii)的一种或多种核酸，或如本文所述编码i)、ii)和iii)的一种或多种表达载体。

35、在第五方面，本公开提供了用于对细胞进行基因修饰的试剂盒，其包含i)crispr系统，ii)碱基编辑系统，和iii)rna引导的切口酶，或如本文所述编码i)、ii)和iii)的一种或多种核酸，或如本文所述编码i)、ii)和iii)的一种或多种表达载体。所述试剂盒还可包含用于将核酸或多肽引入宿主细胞的一种或多种组分。在一些实施方案中，所述一种或多种组分选自病毒载体、非整合病毒颗粒、细胞外囊泡、纳米颗粒、细胞穿透肽和供体核酸序列。