一种具有骨组织深层递送能力的荧光探针及其制备方法和应用

本发明属于生物医学纳米材料，具体涉及一种具有骨组织深层递送能力的荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、骨骼是诸多恶性肿瘤远处转移的主要部位，骨转移形成的软组织肿块会对周围重要的神经和血管造成压迫，引起包括严重骨痛、病理性骨折以及脊髓压迫等一系列骨骼相关事件。遗憾的是，多数骨转移患者在被确诊时已处于疾病晚期，且缺乏系统性治疗方案。由于骨组织的致密结缔组织和胶原纤维结构，以及血-骨髓屏障的存在，使得传统药物难以深入到骨组织深层。同时，传统药物缺乏靶向递送机制导致的非特异性全身分布可能对健康组织造成不必要的毒副作用，并可能导致肿瘤组织中的药物浓度不足，从而影响治疗效果。近年来，纳米医学的蓬勃发展为骨转移瘤的诊疗提供了全新的可能。通过引入能与骨组织特异性结合的配体，从而提高了在骨组织中的靶向性和渗透能力。同时，纳米探针还具有优异的生物相容性和荧光性能，能够在体内稳定地对生物组织和细胞进行高分辨率、高灵敏度的成像检测，为骨转移瘤的早期诊断和治疗提供了新的模式。

技术实现思路

1、针对上述问题本发明提供了一种具有骨组织深层递送能力的荧光探针及其制备方法和应用。该纳米探针可通过“主-被动富集作用”，对骨组织表面羟基磷灰石（ha）、骨髓腔内转铁蛋白受体以及巨噬细胞进行全方位富集和渗透。实现近红外二区荧光（nir-iifl）引导的骨转移瘤诊疗一体化协同。

2、为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种具有骨组织深层递送能力的荧光探针，所述荧光探针通过化学还原法构建了由硫醇配体保护的合金结构纳米簇作为内核、在纳米簇外部通过自组装高生物相容性的骨髓源性牛脱铁转铁蛋白(apo-tf)，并予以外部修饰具有巨噬细胞靶向能力的叠氮化合物，所述荧光探针为auag@apo-transferrin-n3（aa@tfn），其结构分布均匀，形貌为类球形。

4、所述荧光探针类球形结构的内核为金银纳米簇并选用还原型谷胱甘肽作为配体，其蕴含的大量羧基可与骨的主要成分羟基磷灰石表面的ca2+特异性结合，提升该探针对于骨组织的亲和力，外部自组装的牛脱铁转铁蛋白(apo-tf)既能提升该探针的生物相容性又可增加对于肿瘤的高通透性和滞留效应（epr效应），同时可以与骨髓腔内广泛分布的转铁蛋白受体结合。其外在修饰的叠氮化合物可与巨噬细胞特异性结合，进一步提升对于肿瘤部位以及骨组织的聚集性。

5、进一步地，所述荧光探针的水合粒径为7-8nm。

6、一种具有骨组织深层递送能力的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

7、s1、选择谷胱甘肽作为硫醇配体保护剂，对被还原出的金、银单质进行保护：在剧烈搅拌下将摩尔比为25：6的haucl4、agno3水溶液添加到去离子水中充分混合，随后按照haucl4、agno3水溶液和还原型谷胱甘肽水溶液的摩尔比为1：1-1：2的比例，加入还原型谷胱甘肽（gsh）水溶液，室温剧烈搅拌15 min，形成澄清透明的混合溶液；

8、s2、向s1所得混合溶液中缓慢滴加与s1中总金属质量比为1：1 - 1：2的apo-tf溶液，剧烈搅拌15 min后得到淡黄色透明的混合溶液；

9、s3、配置浓度为2 m的氢氧化钠溶液缓慢匀速滴加入s2所得混合溶液中，使反应混合物ph值达到11；在此过程中可见溶液由澄清变为浑浊之后转变为澄清的过程；

10、s4、将s3所得溶液迅速通入co氛围并继续搅拌15 min，并将反应混合物在室温避光下缓慢搅拌24 h，得到棕红色产物；

11、s5、将s4反应得到棕红色产物经去离子水洗涤、超滤离心及冷冻干燥后，得到金银合金纳米簇aa@tf；

12、s6、将上述冻干定量后得到的金银合金纳米簇aa@tf配制成浓度为1 mg/ml的水溶液待用，按照摩尔比为0.68：1：11.6的比例取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）、n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）、叠氮化合物，分别配制水溶液后搅拌混合，添加至上述aa@tf水溶液中冰浴搅拌12 h，得到棕黄色产物；

13、s7、将s6反应得到棕黄色产物经去离子水洗涤和超滤离心3次，冷冻干燥，最终得到具有骨组织深层递送能力的乳腺癌骨转移诊疗一体化nir-ii荧光探针aa@tfn。

14、进一步地，步骤s1中所述haucl4、agno3水溶液和还原型谷胱甘肽水溶液的摩尔比为1：1.25-1：2。

15、进一步地，步骤s1与步骤s2中所述剧烈搅拌转速为660 r/min，搅拌时间15 min。

16、进一步地，步骤s4中所述co的通气压强为1bar，通气时间为15min。

17、进一步地，步骤s5中所述超滤离心采用超滤分离管10 kd，转速为3500 r/min，时间为10 min。

18、进一步地，步骤s6中叠氮化合物包括3-叠氮基丙胺或3-叠氮基丙酸。

19、进一步地，步骤s6中所述edc水溶液的浓度为1 mg/ml，用量为1.116 ml；nhs水溶液的浓度为1 mg/ml，用量为0.99 ml；3-叠氮基丙胺溶液的浓度为10 mg/ml，用量为2-3ml；搅拌混合温度为室温，搅拌时间为60 min；aa@tf水溶液的浓度为2 mg/ml，用量为5 ml。

20、进一步地，步骤s7中所述超滤离心采用超滤分离管30 kd，转速为3500 r/min，时间为15 min。

21、本发明的有益效果如下：

22、本发明通过化学还原法及原位自组装，利用简单、高效的工艺以生物内源性apo-tf为载体，成功构筑了一种具有骨组织深层递送能力的荧光探针，具备安全无毒、生物相容好等优势。同时，具备对骨组织表面ha、骨髓腔内转铁蛋白受体以及巨噬细胞进行全方位渗透和富集的“三重”骨靶向能力，弥补了现有探针骨组织穿透能力差、富集效果不佳等诸多缺陷。

技术特征：

1.一种具有骨组织深层递送能力的荧光探针，其特征在于：所述荧光探针通过化学还原法构建了由硫醇配体保护的合金结构纳米簇作为内核、在纳米簇外部通过自组装高生物相容性的骨髓源性牛脱铁转铁蛋白，并予以外部修饰具有巨噬细胞靶向能力的叠氮化合物，所述荧光探针为auag@apo-transferrin-n3，其结构分布均匀，形貌为类球形。

2.根据权利要求1所述的一种具有骨组织深层递送能力的荧光探针，其特征在于：所述荧光探针的水合粒径为7-8nm。

3.一种如权利要求1或2所述的一种具有骨组织深层递送能力的荧光探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的一种具有骨组织深层递送能力的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤s1中所述haucl4、agno3水溶液和还原型谷胱甘肽水溶液的摩尔比为1：1.25-1：2。

5.根据权利要求3所述的一种具有骨组织深层递送能力的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤s1与步骤s2中所述剧烈搅拌转速为660 r/min，搅拌时间15 min。

6.根据权利要求3所述的一种具有骨组织深层递送能力的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤s4中所述co的通气压强为1bar，通气时间为15min。

7.根据权利要求3所述的一种具有骨组织深层递送能力的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤s5中所述超滤离心采用超滤分离管10 kd，转速为3500 r/min，时间为10 min。

8.根据权利要求3所述的一种具有骨组织深层递送能力的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤s6中叠氮化合物包括3-叠氮基丙胺或3-叠氮基丙酸。

9.根据权利要求3所述的一种具有骨组织深层递送能力的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤s6中所述edc水溶液的浓度为1 mg/ml，用量为1.116 ml；nhs水溶液的浓度为1mg/ml，用量为0.99 ml；3-叠氮基丙胺溶液的浓度为10 mg/ml，用量为2-3 ml；搅拌混合温度为室温，搅拌时间为60 min；aa@tf水溶液的浓度为2 mg/ml，用量为5 ml。

10.根据权利要求3所述的一种具有骨组织深层递送能力的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤s7中所述超滤离心采用超滤分离管30 kd，转速为3500 r/min，时间为15 min。

技术总结本发明的目的在于提供一种具有骨组织深层递送能力的荧光探针及其制备方法和应用，属于生物医学纳米材料技术领域，该纳米探针为AuAg@Apo‑Transferrin‑N3，其纳米颗粒分布均匀，形貌为类球形结构；通过化学还原法构建了由金银纳米簇所形成的合金结构作为纳米簇的内核、在纳米簇外部自组装牛脱铁转铁蛋白，并予以修饰具有骨髓源性巨噬细胞靶向的叠氮化合物。得到。该纳米探针可通过“主‑被动富集作用”，对骨组织表面羟基磷灰石、骨髓腔内转铁蛋白受体以及巨噬细胞进行全方位富集和渗透。实现近红外二区荧光引导的骨转移瘤诊疗一体化协同，弥补了现有探针骨组织穿透能力差、富集效果不佳等诸多缺陷。技术研发人员：郑子良,张瑞平,王文轩,马卓,刘琴,郜梦婷,郑晓春受保护的技术使用者：山西医科大学技术研发日：技术公布日：2024/6/13