抑制肝细胞中Fmrp蛋白的表达量的试剂在制备治疗非酒精性脂肪肝病的药物中的应用

本发明属于细胞治疗，具体地说，涉及一种抑制肝细胞中fmrp蛋白的表达量的试剂在制备治疗非酒精性脂肪肝病的药物中的应用。

背景技术：

1、非酒精性脂肪肝(nafld)是目前世界范围内最常见的慢性肝脏疾病之一，其主要临床特征表现为由机体代谢紊乱导致的肝内脂质积累，与肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病等代谢综合征密切相关，是代谢综合征在肝脏中的表现。单纯性脂肪肝还可能进一步发展为非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝纤维化，进而最终转变为肝硬化、甚至是肝癌。近年来，由于全球经济的飞速发展和生活水平的不断提高，人们的生活方式和饮食习惯都发生了巨大的改变，nafld在世界范围内的发病率显著上升，超过四分之一的人群被nafld及相关疾病困扰。

2、目前，生活方式干预依然是nafld治疗最主要的方法，包括改善饮食结构、增加运功等，没有针对nafld的特效药物。因此，治疗nafld药物的研发具有重要的临床价值和潜在的经济效益。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种抑制或干扰肝细胞中fmrp蛋白的表达量和/或活性的试剂在制备预防或治疗非酒精性脂肪肝病的药物中的应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明的第一方面，提供了一种抑制或干扰肝细胞中fmrp蛋白的表达量和/或活性的试剂在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝病的药物中的应用。

4、所述抑制或干扰肝细胞中fmrp蛋白的表达量和/或活性的试剂为干扰rna的试剂，所述干扰rna的试剂为干扰shrna或干扰sirna的试剂，sirna在肝细胞中表达为瞬时表达，利用shrna则可以将病毒等表达载体整合到宿主的肝细胞中实现稳定表达，使抑制作用更持久。

5、所述shrna的序列如seq id no.1、seq id no.2所示：

6、gcatgtgatgctacgtata(seq id no.1)

7、tatacgtagcatcacatga(seq id no.2)

8、所述sirna的序列如seq id no.3、seq id no.4所示：

9、gggucuagcuauugguacutt(seq id no.3)

10、gaggcuucaaaggaaacgatt(seq id no.4)。

11、所述抑制或干扰肝细胞中fmrp蛋白的表达量和/或活性的试剂为能够将fmrp的shrna转导进入宿主肝细胞的腺相关病毒载体或其它表达载体，同样可以是其它如能够与fmrp发生特异性结合并使其失去特定活性的抗体；通过抑制转录、沉默fmrp编码基因而导致fmrp表达下降的mirna；抑制fmrp编码基因表达的反义寡核苷酸；降低fmrp活性的阻断剂；能够特定敲除fmrp编码基因的crispr编辑系统等。

12、所述表达载体选自质粒载体、病毒载体中的至少一种：具体选自抗体、mirna、干扰rna或干扰rna的表达载体、反义寡核苷酸、阻断剂、基因编辑系统、小分子化合物。

13、所述腺相关病毒载体为aav8。aav8具有高亲和力和特异性，能在肝细胞内稳定表达干扰rna。

14、本技术的第二方面，提供了一种fmrp蛋白或fmrp蛋白的编码基因在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝病的药物中的应用，fmrp蛋白或fmrp蛋白的编码基因作为靶点可以筛选预防和/或治疗非酒精性脂肪肝病的药物。

15、本技术的第三方面，提供了一种预防和/或治疗非酒精性脂肪肝病的药物筛选方法，该筛选方法包括以下步骤：检测受试对象在药物施用前后的fmrp蛋白的表达量和/或活性的变化。

16、本技术的第四方面，提供了一种检测fmrp蛋白的表达量和/或活性的试剂在制备非酒精性脂肪肝病的诊断和/或预后的试剂中的应用。

17、所述检测fmrp蛋白的表达量和/或活性的试剂是指含有抑制或干扰肝细胞中fmrp蛋白的表达量和/或活性的试剂。

18、所述抑制或干扰肝细胞中fmrp蛋白的表达量和/或活性的试剂为干扰rna的试剂，所述干扰rna的试剂为干扰shrna或干扰sirna的试剂，sirna在肝细胞中表达为瞬时表达，利用shrna则可以将病毒等表达载体整合到宿主的肝细胞中实现稳定表达，使抑制作用更持久。

19、所述shrna的序列如seq id no.1～2所示：

20、gcatgtgatgctacgtata(seq id no.1)

21、tatacgtagcatcacatga(seq id no.2)

22、所述sirna的序列如seq id no.3～4所示：

23、gggucuagcuauugguacutt(seq id no.3)

24、gaggcuucaaaggaaacgatt(seq id no.4)。

25、非酒精性脂肪肝(nafld)是目前世界范围内最常见的慢性肝脏疾病之一，其主要临床特征表现为由机体代谢紊乱导致的肝内脂质积累，与肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病等代谢综合征密切相关，是代谢综合征在肝脏中的表现。单纯性脂肪肝还可能进一步发展为非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝纤维化，进而最终转变为肝硬化、甚至是肝癌。近年来，由于全球经济的飞速发展和生活水平的不断提高，人们的生活方式和饮食习惯都发生了巨大的改变，nafld在世界范围内的发病率显著上升，超过四分之一的人群被nafld及相关疾病困扰。但是，目前nafld仍没有明确的治疗方法。因此，如何有效预防nafld的发生，如何改善nafld的症状，缓解其向肝癌进展，成为了近年来科研人员关注的热点。

26、由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：

27、本发明提供的抑制或干扰肝细胞中fmrp蛋白的表达量和/或活性的试剂可以作为预防或治疗非酒精性脂肪肝病的药物使用，本发明通过表达载体靶向敲低小鼠肝细胞fmrp蛋白，使fmrp蛋白的表达量下降，可有效缓解非酒精性脂肪肝病动物模型的肝细胞脂肪变性，使血液中总胆固醇和甘油三酯的含量都显著下降。本发明可以预防和/或治疗肝细胞气球样病变；预防和/或治疗非酒精性脂肪肝病；预防和/或治疗肝脏脂质代谢紊乱；预防和/或治疗胰岛素抵抗；降低肝细胞脂质堆积；降低血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶及碱性磷酸酶活力；降低血清中总胆固醇含量；降低血清中甘油三酯含量。

28、nalfd最主要的诱因是肝脏内脂质累积过多，因此通过高脂饮食饲养得到的nafld动物模型、棕榈酸诱导的细胞模型与nafld患者具有较好的一致性。本发明在实验中发现，靶向敲低小鼠肝细胞的fmrp蛋白、降低fmrp蛋白的表达量，可以有效改善nafld小鼠模型的肝细胞气球样变性，显著降低肝细胞脂质堆积，降低血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶及碱性磷酸酶活力，降低血清中总胆固醇含量，降低血清中甘油三酯含量。敲低人肝癌细胞系的fmrp蛋白、降低fmrp蛋白的表达量，可以有效降低细胞中的脂质堆积。因此，可以将fmrp蛋白或fmrp蛋白的编码基因作为靶点进行预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的药物筛选。或可以从候选化合物是否对fmrp蛋白的表达量和/或活性是否存在抑制作用及抑制作用的强弱，进行药物筛选。

29、另外，fmrp蛋白的含量与非酒精性脂肪肝病密切相关，从而可以通过对fmrp蛋白的表达量和/或活性的检测来实现非酒精性脂肪肝病的诊断和/或预后。