一种基于调节发酵环境二氧化碳含量的六神曲发酵炮制方法与流程

本发明属于中药材炮制，具体涉及一种基于调节发酵环境二氧化碳含量的六神曲发酵炮制方法。

背景技术：

1、六神曲又称为六曲、神曲，由辣蓼、青蒿、苍耳、赤小豆、苦杏仁、麦麸和面粉五种草药和辅料遵循一定比例混合后，通过自然发酵制作而成的传统中药曲剂。成品为不规则小块。表面灰黄色，粗糙，质坚脆。微具发酵香气。最早记载在《本草便读》中，是有记录以来最早的曲类中药之一，并且至今仍然在各种中成药中广为应用。六神曲味甘辛而性温，归脾、胃经是传统曲剂中应用非常广泛的一种的发酵曲剂、内服型固体试剂。

2、近年来研究发现六神曲中含有大量的益生菌，不仅可用于调节肠道微生态和保护肠道，还可以抑菌。六神曲属于健胃消食类常用中药，常用于治疗饮食积滞、伤食腹泻和腹胀不适等消化不良症状，研究认为上述功效与六神曲所含的酵母菌和消化酶及维生素有关。近年来有学者从六神曲中分离出大量酵母菌、大量杂菌及少量乳酸菌，并发现六神曲不仅可调整脾虚小鼠肠道的菌群失调，还具有肠道保护作用。通过神曲口服液治疗肠易激综合征患者，发现患者2周后粪便中乳酸杆菌和双歧杆菌数量较治疗前增多，肠杆菌则减少，临床症状改善且有效率明显升高，其结果与疗效肯定的丽珠肠乐治疗组比较，差异无显著性，与未用益生菌制剂的思密达组比较差异有显著性。

3、动物实验与临床实践都表明六神曲具有调整菌群失调，对双歧杆菌、类杆菌等有益于机体的厌氧菌水平的升高具有明显促进作用，可以降低肠杆菌、肠球菌的数量。再次，其能提高超氧化物歧化酶(sod)、黄嘌呤氧化酶(xod)和一氧化氮(no)的水平，降低丙二醛(mda)浓度，具有肠组织保护作用。因此认为六神曲及其复方制剂是一种良好的微生态调节剂。

4、现有的微生态调节剂多是双歧杆菌、乳杆菌等活菌制剂，此类制剂存在活菌数量难以保证、稳定性差、价格相对较高等问题。相比而言，六神曲及其复方制剂具有很大的优越性，如不存在保存活菌的技术难题，且其稳定性强、有效期长，价格较低等，因此具有很高的开发利用价值。

5、研究表明六神曲有较强抑菌、杀菌活性。六神曲对肠道致病菌、常见致病菌的抗菌活性可能是其治疗外感食积不化、腹泻的机理之一。

6、六神曲入药方式主要有粉末入药和煎煮入药两种，以粉末入药为主。含六神曲的成方制剂多数为消食类中成药，如大山楂丸、保和丸及启脾丸等临床常用药，可见其健脾开胃、消食导滞的功效显著。不但如此，六神曲还具有软坚散结、回乳及祛痰的功能。六神曲常与其他药物合用治疗各种小儿腹泻。炒神曲治疗婴儿腹泻，治愈率高，而病毒唑加制神曲可用于治疗婴幼儿秋冬季腹泻。六神曲还可与吴茱萸合用，敷脐治疗风寒性腹泻和食积不化性腹泻。此外，神曲性甘辛温可制磁石咸寒之性，凡丸剂中有金石、贝壳类药物者，可用神曲糊丸和胃以助消化，使金石之药不碍胃气，利于药力运行。

7、六神曲可治疗青春期乳腺增生，子宫肌瘤，肝肿大以及甲状腺结节肿等，且能防止其它软坚散结药物对脾胃的过度伤伐，利于药物运化吸收。研究发现，用白酒将焦神曲调成糊状服用，回乳效果大增，这也印证了《本草纲目》中“神曲炒研酒服可回乳”的记载。鲜为人知的是神曲配合人参具有良好的治痰效果。

8、六神曲还是最常用的助消化、促生长、提高饲料利用率的中草药添加剂之一。含六神曲的复合饲料添加剂不仅能增强畜禽对蛋白的消化力，显著提高家畜的平均增重、产蛋率及饲料利用率，还可缓解热应激等环境因素对动物食欲的负作用，使家畜体重和饲料利用率大幅提高。六神曲与各种中药相互配伍，组成各种促动物生长的良方，效果显著，并且价格低廉，可进一步开发为安全、有效、无污染的新型饲料添加剂。

9、六神曲炮制最早记载在唐代，但多年的历史沿革中存在炮制工艺、方法、分类不同，标准不明确的情况。最早在汉代记载曲剂，在南北朝时期记载烘焙之法，在唐代则演化为炒黄或微黄等炮制方法，宋代则出现炒令香、火炮微黄等制法，元代则演化为湿纸裹煨制法，到了明清两代逐渐出现了炭制、煮制、炒制、酒制等方法，发展到现在常用的炮制方法为炒焦、麸炒等工艺。

10、《本草经疏》曰：“古人用曲剂，造酒之曲，其味甘温，性专消导，行脾胃滞气，散脏腑之冷”。中医主要用麦麸炒制的六神曲用于消食化积、健脾和胃的治疗，经过焦炒或麸炒后的六神曲消化酶水平降低，能够增强止泻、助消化的功效。相关研究表明，经过麸炒后的六神曲杀菌能力会提高，直接缓解腹泻情况，麸炒及炒焦的六神曲利于胃液分泌，能够改善胃推动力，因炮制后所含化学成分不同，临床治疗功效也略有差别，因焦炒和炒六神曲中不含草酸钙，可减少体内结石，减少药物不良作用。

11、古代酒曲主要用于酿制米酒，是直接以未经发芽糖化的谷物作为原料来进行米酒的酿制。从现代对于酒曲的发酵机理研究结果来看，米酒曲中主要菌群为霉菌和酵母菌，酵母菌不能直接利用淀粉进行繁殖，而是需要霉菌在发酵早期产生多种淀粉酶将淀粉分解为糖，在糖化作用过后，酵母菌才能利用分解得到的单糖和低聚糖大量繁殖。研究结果表明，采用传统米酒曲发酵，这个霉菌糖化过程可能持续60h以上，而发酵到第6天，则是酿酒酵母占主导地位，霉菌基本消失。因此，传统的酒曲则兼有糖化和酒化两种作用，其目的是通过微生物和酶的作用将淀粉转化为乙醇，完成其酿造的任务。

12、六神曲则主要作药用，宋代唐慎微《证类本草》云：“曲，疗脏腑中风气，调中下气，开胃消宿食。主霍乱，心膈气，痰逆，除烦，破症结及补虚，去冷气，除肠胃中塞，不下食，令人有颜色，六月作者良，陈久者入药，用之当炒令香，六畜食米胀欲死者，煮曲汁灌之立消，落胎并下鬼胎。又，神曲，使，无毒。能化水谷宿食症气，健脾暖胃”。这里已经将酒曲与神曲并作一条，以开胃、消宿食为主要功效。

13、六神曲的发酵方式分为传统发酵和混合发酵。传统发酵方式是杂菌发酵，这种发酵方式成本虽低但难以控制有害菌污染，六神曲质量难以保证。胡静等研究市面上六神曲中的微生物组成，发现均长有杂菌。贾丹丹等使用对六神曲微生物分离纯化方法共分离出8株细菌、4株丝状真菌和3株酵母菌，发现六神曲传统发酵炮制方式涉及多种微生物共同参与发酵过程。

14、使用混合发酵是目前较高效的方法。郭吉野等通过挑选六神曲中的优势和药效菌种，寻求混合发酵对六神曲质量的效果，得知混合菌发酵可提高六神曲的质量。高万山等指出如果在虫卵生活适宜的条件下，在六神曲发酵的第4天就会有大谷盗的出现，因此在发酵过程中要掌握好湿度和温度以防曲块生虫。在制作方法上，青蒿、辣寥和苍耳草的入药方式不尽相同。王海洋等发现鲜品煎汤入药，发酵后神曲的蛋白酶酶活最高。而徐云等发现以干品煎液入药，消化酶活力最高。因此以纯种菌种发酵代替传统发酵方式，发酵菌种相对固定，以保证六神曲发酵及产生的有效菌种数量多质量好，六神曲药效及质量提供有效保障。

15、中国专利cn 111388605 b公开了一种六神曲的发酵工艺，其包括原料准备、前处理、预发酵、浓缩、混料成型、固态发酵、后处理等步骤，其中采用了液态预发酵和固态发酵相结合的发酵技术；经过预发酵和发酵两步发酵制得六神曲制剂，其具有工艺简单但发酵程度更加的彻底，并且发酵时间短，发酵效率高；制得的六神曲，具有丰富的消化酶，并且其中的消化酶具有良好的酶活性，使得六神曲消食导滞、健脾和胃效果好。

16、中国专利cn 111388606 b公开了一种六神曲发酵前处理工艺，其包括备料、三鲜汁制备、酶解、配制、切割和发酵等步骤。发酵前处理工艺，在六神曲发酵之间经过一系列预酶解处理，使得原料中的各营养组分更易于被米曲霉利用，其具有工艺简单但发酵程度更加的彻底，并且发酵时间短，发酵效率高；本发明中制得的六神曲，具有丰富的消化酶，并且其中的消化酶具有良好的酶活性，使得六神曲消食导滞、健脾和胃效果好。

17、通过上述两件发明专利的发酵工艺制备的六神曲中三种消化酶除蛋白酶之外均具有良好的酶活力，但基于六神曲主要消米面食的特性，其蛋白酶活力降低也是可以理解的；同时，由上述发明制得的六神曲无论是淀粉酶活力、糖化酶活力，还是蛋白酶活力都优于两个对比例中的市售六神曲；因此，由本发明制备获得的六神曲具有比市售六神曲更好的消化酶活性，也即具有更好的消食特性。

技术实现思路

1、申请人对六神曲的发酵工艺做了深入广泛的研究，研究中发现，通过调节发酵环境中二氧化碳的含量，可以进一步提高所制备六神曲中三种消化酶的酶活力。并且令人意想不到的是所得六神曲与不使用此发酵工艺所得到的六神曲相比，还可以更有效地调节肠道菌群。

2、本技术首先公开一种基于调节发酵环境二氧化碳含量的六神曲的发酵炮制方法。

3、所述发酵炮制方法由以下步骤组成：

4、步骤1)备料：准备麦粉、麸皮、赤豆粉、苦杏仁粉、鲜青蒿、鲜辣蓼和鲜苍耳草；

5、步骤2)三鲜汁制备：将鲜青蒿、鲜辣蓼和鲜苍耳草切碎后加水，并向其中加入果胶酶，并将ph值调至3.0～3.5，在27～32℃下搅拌下处理4～6小时，然后将ph值调至7.0～7.5，然后压榨制得三鲜汁；

6、步骤3)酶解：向制得的三鲜汁中加入纤维素酶，在27～32℃下搅拌下处理2～3小时，制得酶解三鲜汁；

7、步骤4)配制：将麦粉、麸皮、赤豆粉和苦杏仁粉混合均匀后加入到三鲜汁中，混合均匀后在25～35℃下搅拌处理3～5小时，之后将含水量降低至10～20wt％制得原料粉；

8、步骤5)切割：将原料粉挤压并切割成型制得软块；

9、步骤6)发酵：将软块发酵制得六神曲。

10、所述步骤1)中，按以下重量份准备原料，麦粉100份，麸皮90～110份，赤豆粉80～100份，苦杏仁粉80～100份，鲜青蒿95～105份，鲜辣蓼85～115份，鲜苍耳草95～105份。

11、所述步骤2)中，鲜青蒿、鲜辣蓼和鲜苍耳草切碎后加入鲜青蒿、鲜辣蓼和鲜苍耳草总重量50～60wt％的水。

12、所述步骤2)中，果胶酶的加入量为鲜青蒿的10～15wt％；

13、所述步骤3)中，纤维素酶的加入量为三鲜汁的3～7wt％。搅拌的速度为4～6rpm.

14、所述步骤4)中搅拌的速度为4～6rpm。

15、采用低速搅拌进行处理，既避免了过于激烈的搅动对酶解过程的影响，也增进物料的散热，使在处理过程中不至于温度过高导致生物酶失效。

16、所述步骤4)中通过低温蒸发的方式降低含水量。

17、所述步骤5)中，制得软块的孔隙率在35％～45％。

18、35％～45％的孔隙率，能够保证软块的强度，同时也能保证后续米曲霉生长所需的空间，利于其汲取养分。

19、所述步骤6)中，米曲霉孢子粉使用前，先用米曲霉孢子粉9～10倍重量的麦粉稀释。

20、所述步骤6)发酵工艺具体为，将步骤5)制得的软块灭菌处理，平铺后在表面拍上麦粉重量0.25～0.35wt％的米曲霉孢子粉，然后在28～32℃，相对湿度85％～95％环境下发酵处理5天，制得六神曲。

21、进一步讲，步骤6)通过通入预热的新鲜空气的方式来维持发酵环境中二氧化碳处于较低水平。

22、进一步讲，步骤6)发酵第1-2天通过通入预热的新鲜空气使发酵环境中二氧化碳小于0.1％。

23、步骤6)发酵第3-5天通过通入预热的新鲜空气使发酵环境中二氧化碳含量维持在1.0-3.0％，直到发酵结束。

24、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

25、传统六神曲制备工艺中，三鲜汁和麦粉、麸皮、赤豆粉、苦杏仁粉混合后就直接制成软块在进行固态发酵处理，发酵过程中米曲霉利用原料中的养分生长并产生一些酶，如淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等，也正是这些具有活性的酶使得六神曲起到了消食导滞、健脾和胃的效果，因此六神曲中淀粉酶、糖化酶和蛋白酶的数量及活性就决定了六神曲的功效；传统工艺中，直接进行固态发酵，对于米曲霉来说原料中的一些养分利用速度较缓慢，并且利用率也不是很高，因此需要增加所制得六神曲的功效，只能采用较长的发酵时间，但即使是延长了发酵时间，其最终的效果也提升有限。

26、本发明中对六神曲的发酵过程做了精细控制，主要特征在于对于发酵过程中，环境中的二氧化碳含量进行控制。利用通入预热空气的方式，控制发酵环境中的二氧化碳含量。发酵所用的微生物为米曲霉，米曲霉是好氧微生物，当氧气不足时，生长受到抑制，在制曲时通入空气排出二氧化碳，既满足米曲霉的好氧要求，又抑制了厌氧菌的繁殖。

27、在发酵初期，通过通入新鲜空气的方法，保证发酵环境中氧气充足，同时排出二氧化碳，使得米曲霉迅速生长。

28、在发酵后期，降低新鲜空气的通入速度，加上米曲霉发酵产生的二氧化碳，使得发酵环境中二氧化碳含量有所增加，优选使得发酵环境中的二氧化碳含量为1.0-3.0％，直到发酵结束。在此浓度下的米曲霉的生长被抑制，从而改变了米曲霉发酵产生的酶种类和数量。令人意想不到的是，所得六神曲中蛋白酶的活力得到显著提升。同时可以更加有效地促进肠道益生菌的生长。

29、本技术最后提供一种六神曲，由前述的六神曲发酵工艺制得。

30、缩略语表：

31、dns试剂：还原糖含量测定的试剂

32、lbs琼脂：乳酸菌选择性琼脂

33、tsc琼脂：产气荚膜梭菌琼脂