环（脯氨酸-酪氨酸）在间充质干细胞外泌体培养中的应用的制作方法

本发明属于生物医药，具体涉及环(脯氨酸-酪氨酸)在间充质干细胞外泌体培养中的应用。

背景技术：

1、外泌体作为一种重要的细胞间通讯载体，已在生物医学领域中显示出其重要的科学和应用价值。它们在细胞信息传递、组织修复、免疫调节以及疾病诊断和治疗等领域中发挥着关键作用。然而，外泌体的规模化制备仍然是一个待解决的重大挑战。随着科研和临床应用需求的增加，开发高效、安全且成本效益高的外泌体生产方法成为了迫切需求。

2、目前，科学家们已经开发出多种方法来促进外泌体的高效产生，包括优化细胞培养条件、使用特殊培养基、以及改变物理或化学刺激等。但这些方法往往伴随着一系列问题，如引入异种蛋白质、成分复杂化、以及潜在的安全性风险等。

3、在生物医学领域，外泌体因其在细胞间通信中的关键作用而备受关注。为了满足科研和临床应用对外泌体的高需求，科学家们开发了多种方法以促进外泌体的高效产生。目前大多数方法应面临着诸多挑战。使用动物血清的培养基可能引入异种蛋白质，这不仅会影响外泌体的纯度和功能，还可能在临床应用中引起免疫反应。此外，特殊的培养条件或刺激手段可能会改变外泌体的成分和性质，使其变得复杂并难以控制。这些问题增加了外泌体在临床应用中的安全性风险。

4、鉴于这些挑战，迫切需要开发成分简单明确、能够高效促进细胞产生外泌体的培养基和方法。理想的解决方案应该能减少异种蛋白的引入，提高外泌体的产量和纯度，同时确保其生物活性和功能的一致性。这要求使用化学成分明确、无动物源成分的培养基，以及精确控制的培养条件。对于外泌体在再生医学、药物递送、疾病诊断和治疗等领域的应用具有重要意义。因此，开发这样的培养基和培养方法不仅对科研具有重要影响，也为外泌体的商业化生产和临床应用打下了坚实的基础。

5、环二肽原本被认为在细菌群体感应调节中具有重要作用，能够抑制细菌生长。但是目前并没有人将其研究用于外泌体的培养。

技术实现思路

1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了cyclo(l-tyr-d-pro)在间充质干细胞外泌体培养中的应用。

2、本发明还要解决的技术问题是提供了一种化学成分明确、成分简单且能够提供最大安全性的培养基及其在外泌体培养中的应用。

3、本发明最后解决的技术问题是提供了一种基于间充质干细胞的外泌体的高效培养方法，能显著提高外泌体产量并具有较高的生物安全性。

4、技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了cyclo(l-tyr-d-pro)在间充质干细胞外泌体培养中的应用。

5、其中，所述间充质干细胞包括3-5代的脐带间充质干细胞或脂肪间充质干细胞中的一种或两种。

6、本技术实现要素：还包括一种eem培养基，所述eem培养基包括dmem、b-fgf、egf、tgf-β和cyclo(l-tyr-d-pro)，所述cyclo(l-tyr-d-pro)终浓度为3-5mg/ml，该培养基的特点是在dmem基础上仅包含b-fgf、egf、tgf-β、cyclo(l-tyr-d-pro)四种成分明确的添加物。

7、其中，所述b-fgf终浓度为10mg/ml，egf终浓度为10mg/ml，tgf-β终浓度为100mg/ml。

8、本发明内容还包括所述的eem培养基在间充质干细胞的外泌体培养中的应用。

9、本发明内容还包括一种基于间充质干细胞的外泌体培养方法，包括以下步骤：

10、(1)间充质干细胞培养：将间充质干细胞接种于孔板中，加入完全培养基培养；

11、(2)间充质干细胞外泌体的产生：细胞培养至细胞80～85％融合时；pbs清洗，并更换为含有cyclo(l-tyr-d-pro)的培养基在低氧环境中培养，每24小时收集培养过细胞的条件化培养基，并更换新的含有cyclo(l-tyr-d-pro)的培养基，共培养10-15天；

12、(3)取收集的条件化培养基，高速离心去除细胞和大碎片，然后超速离心，弃去上清液，将含有外泌体的沉淀重新悬浮，获得外泌体。

13、其中，步骤(1)的间充质干细胞的接种密度为4×105/cm2。

14、其中，步骤(2)中所述含有cyclo(l-tyr-d-pro)的培养基为所述的eem培养基。

15、其中，步骤(2)中的低氧环境为2％的含氧量。

16、其中，步骤(3)中的高速离心转速为1000xg，高速离心时间为10分钟，超速离心转速为110,000xg，离心时间为75分钟。

17、进一步地，本发明获得间充质干细胞外泌体后，复溶至10毫升，以激光动态粒径检测仪计量颗粒数，从而得到外泌体的获得个数。

18、本发明的核心在于使用一种特殊的环二肽物质cyclo(l-tyr-d-pro)，即环(脯氨酸-酪氨酸)。环二肽原本被认为在细菌群体感应调节中具有重要作用，能够抑制细菌生长。然而，在本发明中，科学家们意外发现，当在培养基中添加3-5mg/ml的cyclo(l-tyr-d-pro)时，可以显著增强干细胞产生外泌体的效率。

19、本发明中cyclo(l-tyr-d-pro)的使用简化了培养基的成分，从而降低了引入异种蛋白或其他复杂成分的风险。其次，由于该物质本身具有抑制细菌生长的作用，它在提高外泌体产量的同时也可能提高了整个培养过程的生物安全性。此外，使用这种特殊的环二肽可以为外泌体的生产提供一个更加可控和预测的环境，这对于保证外泌体产品的一致性和质量至关重要。

20、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明意外发现，培养基仅含有b-fgf、egf、tgf-β时，添加3-5mg/ml的cyclo(l-tyr-d-pro)可以显著增强干细胞产生外泌体的效率，获得外泌体大量产生。本发明的cyclo(l-tyr-d-pro)及与合适浓度的b-fgf、egf、tgf-β的配合使用简化了培养基的成分，从而降低了引入异种蛋白或其他复杂成分的风险；另外由于该物质本身具有抑制细菌生长的作用，它在提高外泌体产量的同时也可能提高了整个培养过程的生物安全性。

技术特征：

1.cyclo(l-tyr-d-pro)在间充质干细胞外泌体培养中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞包括3-5代的脐带间充质干细胞或脂肪间充质干细胞中的一种或两种。

3.一种eem培养基，其特征在于，所述eem培养基包括dmem、b-fgf、egf、tgf-β和cyclo(l-tyr-d-pro)，所述cyclo(l-tyr-d-pro)终浓度为3-5mg/ml。

4.根据权利要求3所述的eem培养基，其特征在于，所述b-fgf终浓度为10mg/ml，egf终浓度为10mg/ml，tgf-β终浓度为100mg/ml。

5.权利要求3或4所述的eem培养基在间充质干细胞的外泌体培养中的应用。

6.一种基于间充质干细胞的外泌体培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的基于间充质干细胞的外泌体培养方法，其特征在于，步骤（1）的间充质干细胞的接种密度为4×105/cm2。

8.根据权利要求6所述的基于间充质干细胞的外泌体培养方法，其特征在于，步骤（2）中所述含有cyclo(l-tyr-d-pro)的培养基为权利要求3或4所述的eem培养基。

9.根据权利要求6所述的基于间充质干细胞的外泌体培养方法，其特征在于，步骤（2）中的低氧环境为2%的含氧量。

10.根据权利要求6所述的基于间充质干细胞的外泌体培养方法，其特征在于，步骤（3）中的高速离心转速为1000 xg，高速离心时间为10分钟，超速离心转速为110,000xg，离心时间为75分钟。

技术总结本发明公开了环（脯氨酸‑酪氨酸）在间充质干细胞外泌体培养中的应用。本发明还公开了含有环二肽分子的化学成份限定的培养基及其应用。本发明还公开了一种基于间充质干细胞的外泌体培养方法。本发明的cyclo(l‑Tyr‑d‑Pro)及与合适浓度的b‑FGF，EGF，TGF‑β的配合使用简化了培养基的成分，从而降低了引入异种蛋白或其他复杂成分的风险；另外由于该物质本身具有抑制细菌生长的作用，它在提高外泌体产量的同时也可能提高了整个培养过程的生物安全性。技术研发人员：江笑笑,张振受保护的技术使用者：南京兰伯艾克斯生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/13