一种具有高转染效率和低细胞毒性的改性阳离子基因载体及其制备方法

本发明属于生物医用材料，尤其涉及一种具有高转染效率和低细胞毒性的改性阳离子基因载体及其制备方法。

背景技术：

0、技术背景

1、近年来，基因治疗作为一种全新手段，将在治疗癌症、遗传疾病、基因工程疫苗、自身免疫疾病等领域占据重要地位。

2、基因治疗是指将健康外源基因导入靶细胞，用于纠正或补偿因基因缺陷或者异常引起的疾病，以发挥治疗作用。然而裸露的dna或mrna体积松散，表面带负电，进入细胞是会与细胞膜外层的阴离子之间产生静电排斥作用。这使得核酸分子在不借助其他技术手段时难以独立穿过细胞膜，或穿膜后极易被细胞内部的核酸酶降解。因此，成功的基因治疗依赖于有效的基因载体。

3、一般来说，基因载体主要分为两类：病毒类载体和非病毒类载体。使用病毒载体外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达，但是病毒类载体临床引用中存在免疫原性和遗传毒性等安全隐患。非病毒类载体多为阳离子聚合物，包括聚乙烯亚胺(pei)及其复合物，聚赖氨酸(pll)及其复合物和脂质体等，其中pei25k利用自身特殊的质子海绵效应，实现高效基因递送而成为阳离子基因载体的标准。pei25k的优点在于电荷密度集中，对基因物质有较强的复合能力，在低质量比即能获得最佳转染效率。但pei25k在转运过程中存在较大的细胞毒性，限制了其在临床领域的应用。常见的pll及其复合物也同样面临着电荷密度高，细胞毒性大的问题。pll虽然带有大量正电荷，但不含有能与细胞膜中羧酸、磷酸基团形成氢键的胍基，导致其穿膜能力较弱，难以到达胞内实现转染。因此，设计一种转染效率高，细胞毒性小的基因载体显得尤为重要。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种改性阳离子基因载体及其制备方法和应用，本发明中的改性阳离子基因载转染效率高，细胞毒性低。

2、本发明提供了一种具有高转染效率和低细胞毒性的改性阳离子基因载体，包括超支化聚赖氨酸和接枝在所述超支化聚赖氨酸上的二十聚甘油。

3、所述超支化聚赖氨酸与二十聚甘油的摩尔比为1:(0.5～3)。

4、所述超支化聚赖氨酸的重均分子量为10-25k。

5、本发明提供一种高转染效率低细胞毒性的改性阳离子基因载体的制备方法，包括以下步骤：

6、a)将高碘酸钠naio4加入二十聚甘油水溶液中，进行氧化反应；

7、b)将所述步骤a)中反应后的溶液进行透析；

8、c)将超支化聚赖氨酸的水溶液加入所述步骤b)中反应后的溶液；

9、所述超支化聚赖氨酸与氧化后二十聚甘油的摩尔比为1:(0.5～3)；所述超支化聚赖氨酸的重均分子量为10-25k；

10、d)向步骤c)反应溶液中加入三乙胺作为催化剂，调至ph＝8，进行反应；

11、e)向所述步骤d)反应溶液中加入硼氢化钠，进行还原反应；

12、f)将所述步骤e)中反应后的溶液依次进行透析、冻干，得到阳离子转染基因载体。

13、优选的，所述超支化聚赖氨酸水溶液的浓度为0.1～0.6mg/ml。

14、优选的，所述二十聚甘油水溶液的浓度为0.5～1.8mg/ml。

15、优选的，所述naio4和二十聚甘油的摩尔比为(0.5～2):1。

16、优选的，所述硼氢化钠和接枝二十聚甘油的超支化聚赖氨酸的摩尔比为1:(1～2.5)。

17、优选的，所述步骤a)中的反应温度为30～45℃；

18、所述步骤a)中的反应时间为2.5～4小时。

19、优选的，所述步骤b)中透析的分子量为500。

20、优选的，所述步骤d)中的反应温度为室温；

21、反应时间为10～15小时。

22、优选的，所述步骤e)中的反应温度为室温；

23、反应时间为8～12小时。

24、本发明提供了一种具有高转染效率和低细胞毒的改性阳离子基因载体及其制备方法，包括超支化聚赖氨酸和接枝在所述超支化聚赖氨酸上的二十聚甘油；所述超支化聚赖氨酸与二十聚甘油的摩尔比为1:(0.5～3)。本发明中的阳离子基因载体最佳基因转染效率可达95％以上，且在最佳转染效率的比例时，细胞存活率高。本发明制备的阳离子载体在基因治疗和核酸疫苗等领域发挥作用有巨大的应用前景。

25、本发明的有益效果：

26、1.本发明中基因载体不仅具有高转染效率，而且具有低细胞毒性。

27、2.本发明通过基因转染实验，发现在优化的条件下对egfp dna的转染中，转染效果高于商业pei(polyethylenimine)，且细胞毒性远低于pei。

28、3.本发明通过基因转染实验，发现在优化的条件下对egfp dna的转染中，转染效果高于未改性过的超支化聚赖氨酸，并且细胞毒性未见明显提高。

技术特征：

1.一种具有高转染效率和低细胞毒性的改性阳离子基因载体，其特征在于，包括超支化聚赖氨酸和接枝在所述超支化聚赖氨酸上的二十聚甘油；

2.如权利要求1所述的具有高转染效率和低细胞毒性的改性阳离子基因载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述超支化聚赖氨酸水溶液的浓度为0.1～0.6mg/ml。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述二十聚甘油水溶液的浓度为0.5～1.8mg/ml。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述高碘酸钠和二十聚甘油的摩尔比为(0.5～2):1。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述硼氢化钠和接枝二十聚甘油的超支化聚赖氨酸的摩尔比为1:(1～2.5)。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a)中的反应温度为30～45℃；

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤b)中透析的分子量为500。

9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤d)中的反应温度为室温；

10.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤e)中的反应温度为室温；

技术总结本发明提供了一种具有高转染效率和低细胞毒性的改性阳离子基因载体及其制备方法，所述改性阳离子基因载体包括超支化聚赖氨酸和接枝在所述超支化聚赖氨酸上的二十聚甘油；所述超支化聚赖氨酸与二十聚甘油的摩尔比为1:(0.5～3)。本发明中的改性阳离子基因载体最佳基因转染效率可达95％以上，且在最佳转染效率的比例时，细胞存活率高。本发明还提供了一种高专效率低细胞毒性的阳离子载体的制备方法。技术研发人员：高长有,余璐萍,王兆龙,胡乔巨,段翼远受保护的技术使用者：浙江大学绍兴研究院技术研发日：技术公布日：2024/6/18