一种基于ITS杂合位点判断杂牛膝及其杂交渐渗程度的方法及其应用与流程

本发明涉及川牛膝鉴别，特别涉及一种基于its杂合位点判断杂牛膝及其杂交渐渗程度的方法及其应用。

背景技术：

1、川牛膝来源于苋科植物川牛膝 cyathula officinaliskuan的干燥根，收载于《中国药典》2020年版一部。味甘、微苦，平，归肝、肾经。具有逐瘀通经，通利关节，利尿通淋的功效。常用于治疗经闭癥瘕，胞衣不下，跌扑损伤，风湿痹痛，足痿筋挛，尿血血淋等症。麻牛膝为苋科植物头花杯苋 cyathula capitata（wall.）moq.的干燥根，又称苦牛膝、红牛膝、金河牛膝，在四川省内分布广泛，其植物形态与川牛膝极为相似，难以区分，且川牛膝和麻牛膝均为苋科杯苋属植物，亲缘关系相近，缺少生殖隔离，且分布区域存在交叉，导致杂牛膝的产生。目前鉴别杂牛膝的方法主要为形态学鉴别，但是在杂交渐渗的过程中，杂交种可能和某一亲本物种极为相似，仅仅依靠形态学难以对杂牛膝进行有效鉴别，导致许多杂牛膝被当成川牛膝或麻牛膝使用。现有的文献研究利用同工酶带谱及染色体技术对杂牛膝进行鉴别，但需要使用新鲜幼嫩的叶片组织，且存在精度不足的缺陷。现有方法无法针对杂交程度低的杂牛膝进行精确的鉴别，针对杂牛膝的杂交渐渗程度无法给出准确的判断，无法满足针对市场干的川牛膝药材进行鉴别，严重影响着市场川牛膝的质量及纯化川牛膝种质资源的道路，因此需要开发一种能够适用于川牛膝药材且简便易行的鉴别手段。

2、随着分子生物学的发展，准确性更高的分子鉴定技术已经被广泛应用于物种鉴定中。基于碱基差异的dna条形码技术，包括核糖体基因及其转录间隔区its/its2序列和叶绿体片段 matk、 rbcl、 trnh-psba等序列鉴定具有结果客观、识别和技术简单、成本低的优势，常用于亲缘关系分析和物种鉴别中。其中核基因序列为双亲遗传，种间杂交种的后代会包含来自双亲物种的序列，该序列是研究植物属内种间系统发育研究和自然杂交判断的理想片段。

3、cn202311380775.1公开了一种鉴别川牛膝、麻牛膝及其自然杂交种的hrm鉴别方法，虽然能够快速鉴别川牛膝、麻牛膝及杂交种，但存在分辨a/t或c/g单碱基突变难度较大及因解链温度受mg2+浓度和一些抑制剂影响较大而对样本纯化、加样准确度的要求稍高的缺陷，但需使用实时荧光定量pcr仪，实验技术难度和成本较高，且无法辨认杂牛膝的杂交渐渗程度。

4、上述背景技术是为了便于理解本发明，并非是申请本发明之前已向普通公众公开的公知技术。

技术实现思路

1、针对上述缺陷，本发明提供一种基于its杂合位点判断杂牛膝及其杂交渐渗程度的方法，该方法能够从实际检验中有效区分杂牛膝，并能够判断其杂交程度。

2、技术方案是：一种基于its杂合位点判断杂牛膝及其杂交渐渗程度的方法，包括以下步骤：

3、s1，提取样本dna；

4、s2，pcr扩增及测序，获得序列峰图；pcr扩增中，上游引物碱基序列为seq id no：1，下游引物碱基序列为seq id no：2；

5、s3， 结果判断：打开序列峰图，分析样本的测序结果，进行序列拼接时修改杂合碱基，通过碱基位点结合形态学判断杂牛膝的杂交渐渗程度。

6、本发明its序列为核基因序列，能够包含双亲的遗传信息，是研究种间杂交种的理想序列，本发明使用its序列对杂牛膝进行鉴别，不仅能够揭示杂牛膝的杂交起源，还能对杂牛膝的杂交渐渗程度进行判断；本发明鉴别方法简单易行，对模板质量要求不高，能够对dna降解较为严重的杂牛膝及饮片进行鉴别，数据处理及分析步骤较为简单，仅需根据杂合位点判断基因型。方法建立后能对市场上流通的川牛膝药材进行有效检测，可以鉴别杂牛膝及杂交程度。

7、进一步地，所述序列峰图通过“chromas”软件打开，序列拼接使用“dnastar”软件，序列拼接时将两段信号差的部分去掉，手动修改所述杂合碱基。

8、进一步地，所述pcr扩增的反应物包括：2×taq pcr mix 12.5μl，上下游引物各1μl，s2的dna模板1μl，ddh2o 9.5μl；所述pcr扩增的扩增程序为：95℃ 3min，35 cycles×(95℃ 45s；58℃ 30s；72℃ 1min)，72℃ 5 min。

9、本发明还提供一种基于its杂合位点判断杂牛膝及其杂交渐渗程度的方法的应用。

10、技术方案是：上述基于its杂合位点判断杂牛膝及其杂交渐渗程度的方法应用于鉴别川牛膝。

11、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

12、形态学分类是目前传统且普遍的一种物种分类方法，在被子植物、裸子植物和蕨类植物的物种分类和鉴别中有广泛的应用；但是形态学分类具有一定的局限性，特别是在面对杂交-渐渗物种的鉴定时，难以满足鉴定需求；分子鉴定技术能够更为准确的研究物种的基因型，能够揭示杂交物种的真面目；its序列能够包含双亲遗传的信息，种间杂交种的后代会包含来自双亲物种的序列，是研究植物自然杂交物种的理想片段；在本发明中，its序列共存在9个杂合位点，为鉴别杂牛膝的理想条带，一部分杂交种与川牛膝和麻牛膝极为相似，凭借原植物形态难以鉴别，一部分可以通过形态学手段直观、简单判断为杂牛膝。因此，本发明在形态学的基础上结合分子生物学手段能更加客观、有效地实现杂牛膝的鉴别。

13、本发明使用its序列针对杂牛膝及其亲本物种进行研究，解决了杂牛膝难以鉴别的问题相较于性状鉴别能够对杂交程度较低的杂牛膝进行有效区分，且不依赖鉴定人员的经验；且对样品要求不高，能够适用于dna降解较为严重的中药材，有良好的扩增测序成功率，能够从实际检验中有效区分杂牛膝，并能够判断其杂交程度。

技术特征：

1.一种基于its杂合位点判断杂牛膝及其杂交渐渗程度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于its杂合位点判断杂牛膝及其杂交渐渗程度的方法，其特征在于，所述修改杂合碱基的修改规则如表2；

3.根据权利要求2所述的基于its杂合位点判断杂牛膝及其杂交渐渗程度的方法，其特征在于，s3中，碱基位点中，变异位点如表3，其中杂合位点为80、130、146、206、225、226、238、240、244，合计9个位点；

4.根据权利要求3所述的基于its杂合位点判断杂牛膝及其杂交渐渗程度的方法，其特征在于，s3中，结合杂牛膝的形态和基因型能将杂牛膝按照杂交程度的不同分为如表4的type1、type2和type3，其中，type1为杂牛膝中偏向川牛膝形态的类型，type1在146、226、290位点均表现为不杂合；type2为杂牛膝呈现典型杂牛膝形态的类型，其表现为植株高度异常，根黄棕色，绝大部分无主根，分枝多且密集，皮孔形态为圆形凸起；type3为杂牛膝中偏向麻牛膝的类型，绝大部分根颜色为红棕色皮孔形态均为圆凸；

5.根据权利要求1所述的基于its杂合位点判断杂牛膝及其杂交渐渗程度的方法，其特征在于，所述序列峰图通过chromas软件打开，序列拼接使用dnastar软件，序列拼接时将两段信号差的部分去掉，手动修改所述杂合碱基。

6.根据权利要求1所述的基于its杂合位点判断杂牛膝及其杂交渐渗程度的方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应物包括：2×taq pcr mix 12.5μl，上下游引物各1μl，s2的dna模板1μl，ddh2o 9.5μl，其中，上游引物为its4：tcctccgcttattgatatgc，下游引物为its5：ggaagtaaaagtcgtaacaagg；所述pcr扩增的扩增程序为：先95℃ 3min；然后 95℃ 45s，58℃30s，72℃ 1min， 循环35 次；最后72℃ 5 min。

7.权利要求1-6任一所述的基于its杂合位点判断杂牛膝及其杂交渐渗程度的方法应用于鉴别川牛膝。

技术总结本发明公开了一种基于ITS杂合位点判断杂牛膝及其杂交渐渗程度的方法及其应用，属于中药材鉴别领域，基于ITS杂合位点判断杂牛膝及其杂交渐渗程度的方法，包括以下步骤：S1，提取样本DNA；S2，PCR扩增及测序，获得序列峰图；S3，结果判断：打开序列峰图，分析样本的测序结果，进行序列拼接时修改杂合碱基，通过碱基位点结合形态学判断杂牛膝的杂交渐渗程度。本发明能够从实际检验中有效区分杂牛膝，并能够判断其杂交程度。技术研发人员：高必兴,徐新颖,何成军,齐景梁,马彦红,苟琰,李倩,汤敏,周娟,李敏受保护的技术使用者：四川省药品检验研究院（四川省医疗器械检测中心）技术研发日：技术公布日：2024/6/18