一种抗人CD36的单克隆抗体和重组抗体及其应用的制作方法

本发明涉及生物，主要涉及一种抗人cd36的单克隆抗体和重组抗体及其应用。

背景技术：

1、cd36（分化簇 36）也称为血小板膜糖蛋白 iv (gpiv)、脂肪酸转位酶 (fat)、血小板反应蛋白受体、胶原受体和 b 类清道夫受体，成员 3 (srb3)，是该类的成员b 细胞表面蛋白清道夫受体家族。人类 cd36 基因编码单链 472 个氨基酸残基蛋白，含有 n 端和 c端胞质尾以及细胞外环。cd36 存在于血小板、红细胞、单核细胞、分化脂肪细胞、乳腺上皮细胞、脾细胞和一些皮肤微真皮内皮细胞。是一种多配体模式识别受体，可与大量结构不同的配体相互作用，包括长链脂肪酸 (lcfa)、晚期糖基化终末产物 (age)、血小板反应蛋白-1、氧化低密度脂蛋白 (oxldl)、高密度脂蛋白 (hdl)、磷脂酰丝氨酸、凋亡细胞、β-淀粉样原纤维 (faβ)、i 型和 iv 型胶原蛋白以及恶性疟原虫感染的红细胞，与不同的配体结合而介导不同的生物学功能，从而参与了癌症、代谢性炎症综合征及心血管等多种疾病的病理过程。cd36其高表达可促进机体对脂质的摄入和吸收，加速以巨噬细胞为首的慢性炎症反应，增加代谢性炎症疾病的危险因素，成为代谢性炎症疾病的相关血清标志物。同时cd36表达缺失的人群会引起一系列免疫性血小板减少的临床病症，其中包括胎儿/新生儿同种免疫性血小板减少症(fetal/ neonatal alloimmune thrombocytopenia，fnait)、血小板输注无效(platelet refractoriness, ptr)和输血后紫癜(post-transfusion purpura,ptp)以及输血相关性急性肺损伤( transfusion-relatedacute lung injury, trali) 可见, cd36抗体的产生具有重大意义，临床上应在免疫系统中重视cd36抗体的检测。

2、目前临床上通常通过elisa、maipa等方法来检测cd36蛋白的表达状况。但是所有应用的抗体当中没有一个抗体是足够敏感和足够特异，检测存在检测灵敏度不高、特异性不强、检测结果与临床病理不符等问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种抗人cd36的单克隆抗体和重组抗体及其应用。本发明以包含从百普赛斯采购的重组人cd36（cd6-h5221）蛋白为抗原进行动物免疫，以另一种从百普赛斯采购的重组人cd36（cd6-h5258）蛋白为抗原包被酶标板进行elisa筛选，制备出特异性靶向抗cd36位点的单克隆抗体，该抗体亲和力高、特异性强。将产生所述单克隆抗体的杂交瘤cd36-14.5进行可变区测序（seq id no:1、seq id no:2），以palter为表达载体制备基因工程重组质粒、以hek293t细胞为宿主细胞进行重组抗体瞬时表达，达到快速获得该抗体的目的。一方面，本发明提供了一种抗人cd36单克隆抗体，所述抗人cd36单克隆抗体包含：

2、抗体重链互补决定区，其包含：cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3，其中：

3、cdr-h1为如seq id no:11所示的氨基酸序列，

4、cdr-h2为如seq id no:12所示的氨基酸序列，

5、cdr-h3为如seq id no:13所示的氨基酸序列；

6、抗体轻链互补决定区，其包含：cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3，其中：

7、cdr-l1为如seq id no:14所示的氨基酸序列，

8、cdr-l2为如seq id no:15所示的氨基酸序列，

9、cdr-l3为如seq id no:16所示的氨基酸序列。

10、进一步的，其重链可变区具有如seq id no:1所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如seq id no:2所示的氨基酸序列。

11、所述抗人cd36单克隆抗体的重链全长序列如seq id no:9所示，轻链全长序列如seq id no:10所示。

12、本发明提供了一种抗人cd36抗体的氨基酸序列，通过该序列可以利用现有技术获得表达抗人cd36抗体的基因工程细胞，提高了cd36抗体的产率和生产稳定性，并且该抗体亲和力高，特异性强；并利用该转染细胞对cd36抗体通过流式细胞检测和血小板抗原单克隆抗体特异性免疫固定检测 (maipa) 鉴定和诊断。maipa 结果显示，与商业化单克隆抗体fa6-152 相比，该单克隆抗体灵敏度更高；利用转染细胞建立的流式检测方法简便易行，结果可靠，可广泛开展。

13、另一方面，本发明提供了制备所述抗人cd36单克隆抗体的方法，包括以下步骤：

14、(1)使用重组人cd36蛋白进行小鼠免疫，检测小鼠血清抗体效价，选取抗体效价最高的小鼠；

15、(2)取步骤(1)选择的小鼠的脾淋巴细胞与sp2/0小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，得到杂交瘤细胞；

16、(3)筛选阳性杂交瘤细胞株；

17、(4)利用步骤(3)选取的阳性杂交瘤细胞株制备抗人cd36单克隆抗体。

18、具体地，制备所述抗人cd36单克隆抗体可按照下述步骤进行：

19、(1)使用百普赛斯重组人cd36（30-439-his）蛋白进行小鼠免疫，使用百普赛斯重组人cd36（30-439-fc）蛋白进行elisa测试，选取抗体效价最高的小鼠；

20、(2)取步骤(1)选择的小鼠的脾淋巴细胞与sp2/0小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，于hat培养基中培养，得到杂交瘤细胞；

21、(3)使用百普赛斯重组人cd36（30-439-fc）蛋白筛选杂交瘤细胞，将筛选到的阳性杂交瘤细胞通过有限稀释法进行克隆筛选得到稳定的阳性单细胞株为阳性单克隆稳定株，即用来制备抗人cd36单克隆抗体；

22、(4)使用上述阳性单克隆稳定株进行小鼠腹水的制备，收集腹水，使用protein a/g柱亲和层析纯化腹水，获得抗人cd36单克隆抗体；

23、或者，将上述阳性杂交瘤细胞株的细胞系用血清的dmem培养基培养扩倍，低速离心，弃上清并将细胞转移到无血清培养基继续培养1-2周后，收取细胞悬液，离心后取上清，利用亲和层析法进行纯化，获得抗人cd36单克隆抗体。

24、另一方面，本发明提供了一种抗人cd36重组抗体，所述抗人cd36重组抗体包含：

25、抗体重链互补决定区，其包含：cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3，其中：

26、cdr-h1为如seq id no:11所示的氨基酸序列，

27、cdr-h2为如seq id no:12所示的氨基酸序列，

28、cdr-h3为如seq id no:13所示的氨基酸序列；

29、抗体轻链互补决定区，其包含：cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3，其中：

30、cdr-l1为如seq id no:14所示的氨基酸序列，

31、cdr-l2为如seq id no:15所示的氨基酸序列，

32、cdr-l3为如seq id no:16所示的氨基酸序列。

33、进一步的，其重链可变区具有如seq id no:1所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如seq id no:2所示的氨基酸序列。

34、进一步的，编码重链可变区的核苷酸序列如seq id no:7所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如seq id no:8所示。

35、另一方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸编码所述抗人cd36重组抗体的重链可变区和/或轻链可变区。

36、进一步的，编码重链可变区的核苷酸序列如seq id no:7所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如seq id no:8所示。

37、另一方面，本发明提供了一种重组表达载体，含有所述的核酸，或含有由所述的核酸编码的氨基酸序列。

38、在一些方式中，由seq id no:3所示的小鼠重链信号肽、seq id no:1所示的单克隆重链可变区序列和seq id no:4所示的小鼠igg恒定区序列插入真核表达载体pcdna3.1而得；和/或由seq id no:5所示的小鼠kappa链信号肽、seq id no:2所示的单克隆轻链可变区序列和seq id no:6所示的小鼠kappa链恒定区序列插入真核表达载体pcdna3.1而得。

39、另一方面，本发明提供了制备所述抗人cd36重组抗体的方法，包括以下步骤：

40、(1) 向真核表达载体pcdna3.1分别插入seq id no:1所示的单克隆重链可变区序列、seq id no:2所示的单克隆轻链可变区序列，得到重组表达载体1、重组表达载体2；

41、(2)将步骤(1)制备得到的重组表达载体1和重组表达载体2转入大肠杆菌dh52中，大量培养后进行质粒提取；

42、(3)将步骤(2)提取的质粒转染至hek293t细胞。

43、具体的，制备所述抗人cd36重组抗体可参照以下步骤进行：

44、(1)将seq id no:3所示的小鼠重链信号肽、seq id no:1所示的单克隆重链可变区序列和seq id no:4所示的小鼠igg恒定区序列插入真核表达载体pcdna3.1，得到重组表达载体1；

45、将seq id no:5所示的小鼠kappa链信号肽、seq id no:2所示的单克隆轻链可变区序列和seq id no:6所示的小鼠kappa链恒定区序列插入真核表达载体pcdna3.1，得到重组表达载体2；

46、(2)将步骤(1)制备得到的重组表达载体1和重组表达载体2转入大肠杆菌dh52中，大量培养后进行质粒提取；

47、(3)将步骤(2)提取的质粒转染至hek293t细胞。

48、一种抗人cd36单克隆抗体或抗人cd36重组抗体用于制备检测cd36蛋白的产品的用途，所述抗人cd36单克隆抗体或抗人cd36重组抗体包含：

49、抗体重链互补决定区，其包含：cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3，其中：

50、cdr-h1为如seq id no:11所示的氨基酸序列，

51、cdr-h2为如seq id no:12所示的氨基酸序列，

52、cdr-h3为如seq id no:13所示的氨基酸序列；

53、抗体轻链互补决定区，其包含：cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3，其中：

54、cdr-l1为如seq id no:14所示的氨基酸序列，

55、cdr-l2为如seq id no:15所示的氨基酸序列，

56、cdr-l3为如seq id no:16所示的氨基酸序列。

57、进一步的，所述抗人cd36单克隆抗体或抗人cd36重组抗体的重链可变区具有如seq id no:1所示的氨基酸序列，轻链可变区具有如seq id no:2所示的氨基酸序列。

58、进一步的，所述检测cd36蛋白的产品包括试剂盒、试纸条、芯片等，任何形式的检测cd36蛋白的产品，含有本发明的抗人cd36单克隆抗体或抗人cd36重组抗体，均属于本发明的保护范围之内。

59、进一步的，所述检测cd36包括免疫组织化学、流式细胞术、免疫印迹、免疫共沉淀、免疫荧光、elisa方法中的任意一种或多种。

60、再一方面，本发明提供了一种检测cd36蛋白的产品，含有所述的抗人cd36单克隆抗体，或含有所述的抗人cd36重组抗体。

61、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

62、1、本发明提供了一种抗人cd36抗体的具体氨基酸序列，通过该序列可以利用现有技术获得表达抗人cd36抗体的基因工程细胞，提高了cd36抗体的产率和生产稳定性。

63、2、本发明的抗人cd36单克隆抗体或重组抗体具有更高的亲和力和特异性，通过流式细胞检测和血小板抗原单克隆抗体特异性免疫固定检测 (maipa) 鉴定和诊断，其灵敏度高于商业化单克隆抗体。

64、3、利用转染细胞建立的流式检测方法简便易行，结果可靠，有利于大规模cd36蛋白检测方法的构建和工业化，应用前景广泛。