一种甲苯磺酸艾多沙班手性中间体的生物合成方法及生物酶与流程

本发明涉及酶工程，具体领域为一种生物酶以及甲苯磺酸艾多沙班手性中间体的生物合成方法。

背景技术：

1、2015年，由日本第一三共公司开发的艾多沙班对甲苯磺酸盐一水合物(商品名：savaysa)获fda批准上市。甲苯磺酸艾多沙班(edxb)是日本上市的首个口服给药的抗凝药物，在全球也是首次问世。edxb为直接fxa抑制剂，而fxa正是当今开发新一代抗凝药物的主要靶点。口服给药为临床用药提供方便，临床试验验证了本品安全有效。edxb将在抗凝药物领域占据更多的优势。

2、甲苯磺酸艾多沙班，化学名为n1-(5-氯吡啶-2-基)-n2-((1s,2r,4s)-4-((二甲氨基)羰基)-2-(((5-甲基-4,5,6,7-四氢噻唑并[5,4-c]吡啶-2-基)甲酰基)氨基)环己基)乙二酰胺对甲苯磺酸一水合物，edxb(1s，2r，4s)的结构式详见下式。

3、

4、甲苯磺酸艾多沙班(edxb)作为小分子化药，目前虽然现有技术中主要合成方法是通过化学合成(如cn114736218a)，其中有一个关键的手性氨(结构如上式所示)，通过化学合成法添加，该方法反应条件苛刻，手性收率较低，且使用大量有机溶剂，对环境不友好。

5、因此，本领域亟需开发出一种方法简单易行、条件温和、对环境友好且能够经济化添加手性氨的合成路线。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种生物酶。

2、本发明的第二目的在于提供上述生物酶的制备方法。

3、本发明的第三目的在于提供采用上述生物酶进行甲苯磺酸艾多沙班中间体生物合成的方法。

4、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

5、一种生物酶，其核苷酸序列如seq id no：3所示；其氨基酸序列如seq id no：4所示。

6、本发明上述生物酶的制备方法为：

7、以pet-28a质粒为载体，表达转氨酶基因；所述转氨酶基因的序列如seq id no：3所示。转氨酶突变体基因经过dna序列合成后进行pcr扩增，然后连接到pet-28a质粒的ecori和hind iii位点，转化到大肠杆菌bl21(de3)中进行表达。经过抗生素抗性平板涂布筛选后，获得克隆菌株escherichia coli，工程菌编号t-001。经检验重组成功后，对获得的菌株在37℃，lb培养基中进行过夜活化后加入200ml发酵液(tb培养基)中，培养至od 600值为0.6～0.8，加入终浓度为0.5mm的iptg，18℃继续培养16h后，12000rpm，4℃下离心收集菌株，采用ph值为7.0的0.2m的pb缓冲液洗涤后收集菌株，加入15ml缓冲液通过超声波破碎后冻干，获得冻干酶。

8、采用上述生物酶进行甲苯磺酸艾多沙班中间体生物合成的方法，具体为：

9、由化合物ii作为起始原料，在缓冲液、助溶剂、辅酶plp、氨基供体的存在下，经生物酶催化转化为化合物i，其反应路线为，

10、

11、其中，所述化合物ii和生物酶的质量优选为1:20。。

12、其中，所述氨基供体为异丙胺或丙氨酸。

13、其中，所述化合物ii与所述氨基供体的摩尔比为1:1～10；优选为1:1～5。

14、其中，所述缓冲液为hepes缓冲液或磷酸盐缓冲液或异丙胺盐酸盐。

15、其中，所述助溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、dmso中的任意一种，优选为dmso；

16、其中，所述化合物ii与助溶剂的质量体积比为1:10～50g/ml；

17、其中，所述助溶剂与缓冲液的体积比为为1:10。

18、其中，所述生物酶与辅酶plp的质量比为10～100:1。

19、其中，所述化合物ii经生物酶催化反应时，反应温度为20～40℃。

20、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

21、本发明提供了一种转氨酶突变体，可用于甲苯磺酸艾多沙班中间体的生物合成。本发明的生物合成方法解决了现有技术中手性中间体获得产率低、制备困难、反应时间长、合成工艺复杂等问题，对环境友好、绿色无污染，具有经济化的应用前景。

技术特征：

1.一种生物酶，其特征在于：其核苷酸序列如seq id no.3所示。

2.根据权利要求1所述的生物酶，其特征在于：其氨基酸序列如seq id no.4所示。

3.权利要求1或2所述的生物酶的制备方法，其特征在于：将过表达转氨酶的重组工程菌escherichia coli，工程菌编号t-001接种至lb液体培养基中，接种量为培养基体积的1～5％，37℃的条件下，220rpm摇床中过夜培养后，作为种子液；将新鲜的种子液接入tb培养基中发酵培养，37℃的条件下，220rpm摇床中培养至od600在0.6～0.8时向培养基中加入iptg，iptg的浓度为0.5mm，再于18℃诱导16h；发酵液诱导结束后，于4℃，12000rpm离心5min，收集菌体；用ph7.0，0.2m的pb缓冲液重洗后重悬，超声破碎后冻干，获得冻干酶粉。

4.采用权利要求1或2所述的生物酶进行甲苯磺酸艾多沙班中间体生物合成的方法，其特征在于：由化合物ii作为起始原料，在缓冲液、助溶剂、辅酶plp、氨基供体的存在下，经生物酶催化转化为化合物i，其反应路线为，

5.根据权利要求3所述的甲苯磺酸艾多沙班中间体生物合成的方法，其特征在于：所述化合物ii和生物酶的质量比为1:20。

6.根据权利要求3所述的甲苯磺酸艾多沙班中间体生物合成的方法，其特征在于：所述氨基供体为异丙胺或丙氨酸；所述化合物ii与所述氨基供体的摩尔比为1:1～10；优选为1:1～5。

7.根据权利要求3所述的甲苯磺酸艾多沙班中间体生物合成的方法，其特征在于：所述缓冲液为hepes缓冲液或磷酸盐缓冲液或异丙胺盐酸盐。

8.根据权利要求3所述的甲苯磺酸艾多沙班中间体生物合成的方法，其特征在于：所述助溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、dmso中的任意一种，优选为dmso；

9.根据权利要求3所述的甲苯磺酸艾多沙班中间体生物合成的方法，其特征在于：所述生物酶与辅酶plp的质量比为10～100:1。

10.根据权利要求3所述的甲苯磺酸艾多沙班中间体的生物合成方法，其特征在于：反应温度为20～40℃。

技术总结本发明涉及酶工程技术领域，尤其是一种甲苯磺酸艾多沙班手性中间体的生物合成方法及生物酶，该方法由化合物II作为起始原料，在缓冲液、助溶剂、辅酶PLP、氨基供体的存在下，经生物酶催化转化为化合物I，其反应路线为，其中，生物酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明方法减少了甲苯磺酸艾多沙班中间体生产过程中化学催化剂的使用，方法简单，反应条件温和，对环境优化，具有广阔的应用前景。技术研发人员：江涛,魏海玉,邓波,杨勤受保护的技术使用者：重庆普佑生物医药有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18