一种干细胞用培养方法与流程

本发明涉及干细胞培养，尤其涉及一种干细胞用培养方法。

背景技术：

1、在干细胞研究和应用领域，培养方法的优化一直是一个核心议题，干细胞，特别是人类胚胎干细胞和成体干细胞，因其多能性和重要的医学应用价值而备受关注，这些细胞能够分化成各种不同类型的细胞，为再生医学、疾病模型构建和药物筛选提供了重要工具，然而，维持干细胞的稳定增殖和多能性状态，同时抑制其非特异性分化，一直是干细胞培养中的主要挑战。

2、现有的干细胞培养技术面临几个主要问题，首先，如何在培养过程中维持干细胞的多能性，防止其非特异性分化，是一大挑战，此外，干细胞的培养环境需要精确控制，包括营养物质的供应、环境条件(如温度、co2浓度和湿度)以及传代培养的有效管理，这些因素对于干细胞的生长和稳定性至关重要，传统方法在操作上往往复杂，且难以保证培养的一致性和重复性，这在高标准的实验室操作和临床应用中尤为重要。

技术实现思路

1、基于上述目的，本发明提供了一种干细胞用培养方法。

2、一种干细胞用培养方法，包括以下步骤：

3、s1：将干细胞在37℃的条件下预培养24小时，使用含10％胎牛血清的dmem培养基；

4、s2：基于s1阶段细胞的适应性增殖，调整新培养基的配方；

5、s3：根据s2阶段培养基的改进，调整培养箱环境，以支持干细胞的生长；

6、s4：每隔一段时间更换一次新鲜的培养基，以去除代谢产物并提供新的营养物质；

7、s5：在培养过程中加入全反式维甲酸，以抑制细胞的非特异性分化；

8、s6：当细胞达到预定的融合率时，使用胰蛋白酶进行细胞分离，并以预定的比例进行传代培养；

9、s7：每进行三代培养后，利用流式细胞术检测干细胞表面标记物，确保其多能性和质量。

10、进一步的，所述s1具体包括：

11、s11：选取存活率控制在90％的干细胞，该干细胞为胚胎干细胞或成体干细胞；

12、s12：准备包含10％胎牛血清dmem，并调节ph值至7.2-7.4，渗透压调节至280-320mosm/kg；

13、s13：将s11选取的干细胞以密度为1×10^5-5×10^5细胞/ml的比例接种于含有预先准备好的dmem培养基的培养容器中；

14、s14：将接种后的细胞置于恒温培养箱中，设定温度为37℃，持续24小时，确保培养箱内的co2浓度维持在5％。

15、进一步的，所述s2具体包括：

16、s21：准备以下原材料：2％l-谷氨酸、0.1％β-巯基乙醇和10-20ng/ml浓度范围内的人类纤维生长因子；

17、s22：在无菌条件下，将上述原材料添加至基础的dmem培养基中，混合均匀；

18、s23：调整新配制的培养基ph值至7.2-7.4，渗透压调节至280-320mosm/kg；

19、s24：通过0.22微米滤膜将培养基过滤灭菌，以除去存在的微生物污染；

20、s25：将s1阶段干细胞培养中使用的旧培养基替换为新配制的培养基。

21、进一步的，所述s3中调整培养箱环境包括：

22、s31：将培养箱的温度设定为37℃，允许的温度波动范围控制在±0.5℃；

23、s32：调节培养箱内的co2浓度至5％，允许的浓度波动范围控制在±0.2％；

24、s33：维持培养箱内的相对湿度在95％，允许的湿度波动范围为±3％。

25、进一步的，所述s4中每隔一段时间具体为36-48小时。

26、进一步的，所述s5具体包括：

27、s51：准备0.5-1μm浓度的全反式维甲酸溶液；

28、s52：将准备好的全反式维甲酸溶液缓慢加入到培养基中；

29、s53：充分混合培养基和全反式维甲酸溶液，以确保药物在培养基中分布均匀。

30、进一步的，所述s6具体包括：

31、s61：首先确定干细胞的预定融合率为90％；

32、s62：制备0.25％胰蛋白酶溶液，首先将胰蛋白酶粉末溶解在无菌的磷酸盐缓冲液中，然后过滤灭菌，以确保溶液的无菌和活性；

33、s63：当细胞达到90％的融合率时，先将培养基从培养皿中移除，然后加入已准备好的0.25％胰蛋白酶溶液，使细胞从培养皿底部分离；

34、s64：在细胞分离后，立即加入含有胎牛血清的dmem培养基，以中和胰蛋白酶的活性，防止细胞过度消化；

35、s65：轻轻震荡培养皿，使分离的细胞悬浮在培养基中，然后收集细胞悬液，并按照1:3的比例将细胞接种到新的培养皿中进行传代培养。

36、进一步的，所述s7具体包括：

37、s71：在完成三代干细胞培养后，细胞从培养皿中收集，确保细胞的完整性和活性；

38、s72：使用特定的抗体标记干细胞的表面标记物，该抗体为oct4或sox2；

39、s73：在标记过程中，根据需要对细胞进行固定和/或渗透处理，以使抗体能够更好地与细胞表面标记物结合；

40、s75：将标记的细胞样本置于流式细胞仪中，进行细胞表面标记物的检测，记录每个细胞的荧光强度，以评估干细胞的多能性。

41、本发明的有益效果：

42、本发明，通过优化干细胞培养的各个阶段，显著提高了培养的效率和稳定性，通过精确调控培养基的成分，如2％l-谷氨酸、0.1％β-巯基乙醇和10-20ng/ml人类纤维生长因子的添加，干细胞能够在更适宜的环境中增殖，同时保持高水平的活性和多能性，此外，通过维持培养环境的严格控制，如温度、co2浓度和湿度的稳定，进一步确保了细胞生长的一致性和重复性。

43、本发明，通过加入0.5μm全反式维甲酸的步骤，有效抑制了干细胞的非特异性分化，这一措施确保了干细胞在增殖过程中保持其原始状态，为后续的研究和应用提供了高质量的细胞源，这一特点在高精度的细胞疗法和组织工程中尤为重要。

44、本发明，利用流式细胞术检测干细胞表面标记物，这一步骤使研究人员能够及时评估干细胞的多能性和整体质量，确保培养过程的成功率和可靠性，这对于那些对细胞质量有严格要求的应用(如再生医学和临床治疗)来说，提供了额外的保障。

技术特征：

1.一种干细胞用培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种干细胞用培养方法，其特征在于，所述s1具体包括：

3.根据权利要求2所述的一种干细胞用培养方法，其特征在于，所述s2具体包括：

4.根据权利要求3所述的一种干细胞用培养方法，其特征在于，所述s3中调整培养箱环境包括：

5.根据权利要求4所述的一种干细胞用培养方法，其特征在于，所述s4中每隔一段时间具体为36-48小时。

6.根据权利要求5所述的一种干细胞用培养方法，其特征在于，所述s5具体包括：

7.根据权利要求6所述的一种干细胞用培养方法，其特征在于，所述s6具体包括：

8.根据权利要求7所述的一种干细胞用培养方法，其特征在于，所述s7具体包括：

技术总结本发明涉及干细胞培养技术领域，具体涉及一种干细胞用培养方法，包括以下步骤：S1：将干细胞在37℃的条件下预培养24小时，使用含10％胎牛血清的DMEM培养基；S2：基于S1阶段细胞的适应性增殖，调整新培养基的配方；S3：调整培养箱环境；S4：每隔一段时间更换一次新鲜的培养基；S5：在培养过程中加入全反式维甲酸；S6：当细胞达到预定的融合率时，使用胰蛋白酶进行细胞分离；S7：每进行三代培养后，利用流式细胞术检测干细胞表面标记物。本发明，通过优化培养基配方、精确控制培养条件，显著提高了干细胞培养的效率和稳定性，同时有效维持细胞的多能性，确保了干细胞的高质量标准，适应于高精度的科学研究和临床应用。技术研发人员：李岩,肖金丽,王慧,李向英受保护的技术使用者：宁夏爱济莱斯生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18