亚胺还原酶突变体及其在合成伊万卡塞手性中间体的应用

本发明涉及生物，尤其是涉及一种亚胺还原酶突变体及其在合成伊万卡塞手性中间体的应用。

背景技术：

1、(s)-3-{[(r)-1-(萘-1-基)乙基]氨基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯作为一种重要的医药中间体，具有广阔的市场前景。日本协和麒麟(kyowa kirin)研发的新一代口服拟钙剂evocalcet(伊万卡塞)，用于治疗继发性甲状旁腺功能亢进症。(s)-3-{[(r)-1-(萘-1-基)乙基]氨基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯是evocalcet的手性源，因此其制备技术是合成evocalcet的关键步骤。

2、目前，(s)-3-{[(r)-1-(萘-1-基)乙基]氨基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯的合成通常有两种方法：(一)用硝基苯磺酰氯活化(r)-1-boc-3-羟基吡咯烷的羟基，再与(r)-1-萘乙胺缩合得到目标产物。(二)通过1-boc-吡咯烷和(r)-1-萘乙胺亲和取代，经手性拆分获得所需光学纯度的中间体。上述的技术方案存在的不足为：制备(s)-3-{[(r)-1-(萘-1-基)乙基]氨基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯需要两步反应，生产成本高，且存在污染大的问题。

3、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种亚胺还原酶突变体，该突变体能够催化合成(s)-3-{[(r)-1-(萘-1-基)乙基]氨基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯，以解决上述问题。

2、本发明的第二目的在于提供亚胺还原酶或其突变体在催化合成(s)-3-{[(r)-1-(萘-1-基)乙基]氨基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯中的应用。

3、本发明的第三目的在于提供一种(s)-3-{[(r)-1-(萘-1-基)乙基]氨基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯的制备方法，该制备方法简单，成本低，环境友好，以解决上述问题。

4、本发明的第四目的在于提供上述制备方法在制备伊万卡塞中的应用。

5、为了实现以上目的，特采用以下技术方案：

6、第一方面，本发明提供了一种亚胺还原酶突变体，所述亚胺还原酶突变体为以seqid no.1所示亚胺还原酶的第219位氨基酸残基发生如下突变后所得突变体的一种：

7、第219位的色氨酸突变为丙氨酸；

8、第219位的色氨酸突变为异亮氨酸；

9、第219位的色氨酸突变为亮氨酸；

10、第219位的色氨酸突变为缬氨酸；

11、第219位的色氨酸突变为苯丙氨酸；

12、第219位的色氨酸突变为天冬酰胺；

13、第219位的色氨酸突变为酪氨酸；

14、第219位的色氨酸突变为天冬氨酸；

15、第219位的色氨酸突变为半胱氨酸；

16、第219位的色氨酸突变为谷氨酰胺；

17、第219位的色氨酸突变为甲硫氨酸；

18、第219位的色氨酸突变为丝氨酸；

19、第219位的色氨酸突变为苏氨酸；

20、第219位的色氨酸突变为精氨酸；

21、第219位的色氨酸突变为组氨酸；

22、第219位的色氨酸突变为赖氨酸；

23、第219位的色氨酸突变为谷氨酸；

24、第219位的色氨酸突变为甘氨酸；

25、第219位的色氨酸突变为脯氨酸。

26、第二方面，本发明提供了一种亚胺还原酶或其突变体在催化合成(s)-3-{[(r)-1-(萘-1-基)乙基]氨基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯中的应用，所述亚胺还原酶的氨基酸序列如seq id no.1所示；亚胺还原酶突变体为所述的亚胺还原酶突变体。

27、作为进一步技术方案，催化合成的反应物包括(r)-1(1-萘基)乙胺和3-氧代吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。

28、第三方面，本发明提供了一种(s)-3-{[(r)-1-(萘-1-基)乙基]氨基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯的制备方法，包括：将(r)-1(1-萘基)乙胺、3-氧代吡咯烷-1-羧酸叔丁酯、nadph、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和亚胺还原酶或其突变体于溶剂中混合，经酶促反应后，制备得到(s)-3-{[(r)-1-(萘-1-基)乙基]氨基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯；

29、所述亚胺还原酶的氨基酸序列如seq id no.1所示；亚胺还原酶突变体为所述的亚胺还原酶突变体。

30、作为进一步技术方案，所述溶剂包括水或缓冲液。

31、作为进一步技术方案，所述缓冲液包括磷酸缓冲液。

32、作为进一步技术方案，所述酶促反应的温度为20-40℃，ph为6-9。

33、作为进一步技术方案，所述酶促反应的温度为25-40℃，ph为7-8。

34、作为进一步技术方案，所述溶剂中还包括助溶剂；

35、所述助溶剂包括dmso、甲醇或乙醇。

36、第四方面，本发明提供了上述制备方法在制备伊万卡塞中的应用。

37、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

38、经发明人研究发现，亚胺还原酶及本发明提供的亚胺还原酶突变体能够催化(r)-1(1-萘基)乙胺和3-氧代吡咯烷-1-羧酸叔丁酯合成(s)-3-{[(r)-1-(萘-1-基)乙基]氨基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯，且突变体催化合成的转化率较突变前最高提高超过8倍，ee值从63％提高到99％。

39、本发明提供的(s)-3-{[(r)-1-(萘-1-基)乙基]氨基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯的制备方法，操作简单，反应条件温和，绿色环保，解决了现有技术中采用化学法制备(s)-3-{[(r)-1-(萘-1-基)乙基]氨基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯过程中存在的化学反应步骤多，操作繁琐，生产成本高，且使用大量有机试剂造成环境污染等问题。

技术特征：

1.一种亚胺还原酶突变体，其特征在于，所述亚胺还原酶突变体为以seq id no.1所示亚胺还原酶的第219位氨基酸残基发生如下突变后所得突变体的一种：

2.亚胺还原酶或其突变体在催化合成(s)-3-{[(r)-1-(萘-1-基)乙基]氨基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯中的应用，其特征在于，所述亚胺还原酶的氨基酸序列如seq id no.1所示；亚胺还原酶突变体为权利要求1所述的亚胺还原酶突变体。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，催化合成的反应物包括(r)-1(1-萘基)乙胺和3-氧代吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。

4.一种(s)-3-{[(r)-1-(萘-1-基)乙基]氨基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯的制备方法，其特征在于，包括：将(r)-1(1-萘基)乙胺、3-氧代吡咯烷-1-羧酸叔丁酯、nadph、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和亚胺还原酶或其突变体于溶剂中混合，经酶促反应后，制备得到(s)-3-{[(r)-1-(萘-1-基)乙基]氨基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯；

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂包括水或缓冲液。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液包括磷酸缓冲液。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述酶促反应的温度为20-40℃，ph为6-9。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述酶促反应的温度为25-40℃，ph为7-8。

9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂中还包括助溶剂；

10.权利要求4-9任一项所述的制备方法在制备伊万卡塞中的应用。

技术总结本发明提供了一种亚胺还原酶突变体及其在合成伊万卡塞手性中间体的应用，涉及生物技术领域。经发明人研究发现，亚胺还原酶及本发明提供的亚胺还原酶突变体能够催化(R)‑1(1‑萘基)乙胺和3‑氧代吡咯烷‑1‑羧酸叔丁酯合成(S)‑3‑{[(R)‑1‑(萘‑1‑基)乙基]氨基}吡咯烷‑1‑羧酸叔丁酯，且突变体催化合成的转化率较突变前最高提高超过8倍，ee值从63％提高到99％。本发明提供的伊万卡塞手性中间体(S)‑3‑{[(R)‑1‑(萘‑1‑基)乙基]氨基}吡咯烷‑1‑羧酸叔丁酯的制备方法，操作简单，反应条件温和，绿色环保。技术研发人员：李军,林钦喆,朱美辰,吕炫瑾,徐神鹏,虞思思,杜文婷受保护的技术使用者：杭州医学院技术研发日：技术公布日：2024/6/18