黄颡鱼SUMO化修饰体系及其构建方法和应用

本发明涉及鱼类生物，涉及蛋白质的翻译后修饰，具体涉及一种黄颡鱼sumo化修饰体系及其构建方法和应用。

背景技术：

1、锌在鱼类体内扮演着关键的角色，分布于生物体各个组织中，在鱼类的生长、骨骼发育、免疫系统、内分泌平衡以及核酸与蛋白质的合成等多个生理活动中都起着至关重要的作用，是其不可或缺的微量元素之一。在鱼类养殖中，锌的合理供应具有重要意义。锌缺乏会引发多种症状，如食欲不振、蛋白质和碳水化合物的消化率降低、生长受抑制、dna损伤以及氧化应激、机体抵抗能力下降、死亡率上升等。然而，过量的锌积累也是有害的，可导致神经和免疫功能受损，最终导致溶血性贫血。饲料中锌含量的不足或过剩都会直接影响鱼类的生长和饲料利用效率。此外，需要注意的是锌是一种重金属元素，其过量排放不仅可能对水体生态系统产生负面影响，还对环境污染构成潜在威胁。因此，深入研究锌的供应和代谢并为水产养殖和饲料生产提供科学有据的精准营养数据，有利于鱼类的健康以及养殖业和饲料行业的生态良好可持续性发展。

2、不论是海水鱼还是淡水鱼，它们都能够从环境中通过鳃和胃肠道系统吸收锌。饲料被认为是鱼类获取锌的主要来源，鱼类对饲料中的锌吸收在肠道前部最高。锌通过肠道上皮细胞的吸收转运，进入到机体中发挥各种生理功能，因此，生物体的锌稳态调控机制显得尤为关键。锌的稳态调节是由锌转运蛋白完成的，这些蛋白负责调控锌在细胞和胞内膜之间的运输。锌在鱼类体内的吸收、转运和稳态调控机制非常复杂，涉及多个关键蛋白质，其中包括znts和zips家族蛋白、金属硫蛋白以及金属反应转录因子1。锌转运蛋白因其分布不同，从而发挥其相应的功能，不同锌转运蛋白的组织表达、细胞定位和调控也具有很大差异，并对饲料锌水平以及生理条件呈现出相应的反应。

3、蛋白质翻译后修饰(ptms)指的是蛋白质在其翻译完成后发生的化学修饰。ptms是一种复杂的过程，几乎涉及到细胞内的所有生命活动，具有关键的调控功能。这些修饰使蛋白质的结构更加复杂，功能更加专一和完善，因此ptms拥有巨大的生命科学研究和探索潜力。sumo(smallubiquitin-relatedmodifier)化修饰作为一种重要的可逆的蛋白质翻译后修饰方式，在调控蛋白质的活性、稳定性和定位方面发挥着极其关键的作用。sumo化修饰在生物体内具有调控生物学过程中的功能，它的功能主要依赖于目的蛋白，而机体内许多与转录调控和信号传导相关的蛋白质都是sumo化修饰的靶蛋白。sumo可与底物蛋白结合，参与调控靶基因的转录活性、维持基因组完整性、调控蛋白质的亚细胞定位以及调节蛋白质稳定性等关键的生物学过程。

4、sumo化修饰过程包含四个连续的酶促反应过程：首先，sumo特异性蛋白酶(sentrin/sumo-specific proteases,senps)促使sumo成熟化，然后e1酶激活sumo，接着活化的sumo与e2酶结合，最后，e3酶促进sumo与底物蛋白结合。首先，sumo的c末端氨基酸会被senps降解，这一过程使得sumo的双甘氨酸残基得以暴露，形成成熟的sumo分子。随后，在atp的参与下，sumo的甘氨酸残基会与e1激活酶的半胱氨酸残基发生结合形成硫酯键，从而生成活化的sumo。e1酶是由sumo活化酶亚基1(sae1)和sumo活化酶亚基2(uba2)构成的atp依赖性异二聚体。sae1/uba2具有特异性，可以识别目前已知唯一的e2结合酶(ubc9)，通过酯交换反应将sumo转移至ubc9的半胱氨酸残基上，形成高能硫酯键。最终，在e3连接酶的催化作用下，ubc9直接辨识底物蛋白中的保守序列ψ-kxd/e，其中ψ代表疏水基团，k代表与sumo结合的赖氨酸，x代表任意氨基酸，d/e代表底物蛋白中的天冬氨酸或谷氨酸等组成的酸性氨基酸，将sumo与底物蛋白的赖氨酸残基结合，形成牢固的异肽键，从而完成sumo与底物蛋白之间的特异性结合。

5、综上所述，锌转运蛋白的正常生理功能对鱼类机体的锌稳态具有至关重要的作用，且sumo化修饰也是机体中各种生物学过程必不可少的。尽管已有组学数据表明许多锌转运蛋白可能是sumo化修饰的靶蛋白，sumo化修饰可能间接调控机体锌稳态，但是哪些锌转运蛋白能够发生sumo化修饰以及sumo化修饰如何调控机体锌稳态目前尚无文献报道。因此，建立科学可靠的黄颡鱼锌转运蛋白sumo化修饰分析鉴定方法，对于研究sumo化修饰调控锌转运蛋白对锌在机体中的代谢和利用具有非常重要的意义。并有助于深入研究sumo化修饰在鱼类锌稳态调控中的作用机理，加强我们对锌的营养及生理功能的认识，为鱼类sumo化修饰的研究和锌稳态的调控提供理论支持和研究手段。此外，本发明还利用该体系方法，结合分子生物学技术，建立了一套筛选、验证黄颡鱼sumo化靶标蛋白和sumo化位点的技术体系和流程，本方法将大大提高黄颡鱼sumo化靶标蛋白和靶位点筛选及鉴定的效率及成功率，并可以用于研究影响黄颡鱼sumo化修饰的激活剂和抑制剂的作用机理和应用。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术的不足，提供一种黄颡鱼sumo化修饰体系及其构建方法和应用，解决的技术问题是克服现有鉴定黄颡鱼体内锌转运蛋白能否发生sumo化修饰方法的复杂繁琐且无法鉴定发生sumo化修饰位点的局限性，以及弥补体外鉴定黄颡鱼sumo化修饰底物和sumo化修饰位点方法的空白。

2、为实现上述目的，本发明提供一种黄颡鱼sumo化修饰体系，所述修饰体系以真核表达质粒载体pcdna3.1(+)为模板，在hindiii和xhoi两个酶切位点之间插入有融合蛋白基因；所述融合蛋白基因为携带标签蛋白基因的sumo化修饰相关蛋白基因。

3、优选地，所述sumo化修饰相关蛋白基因为sumo1、sumo2、sumo3、sae1、uba2、ubc9、pias1、zip8中的任意一种；所述标签蛋白基因为表达以下任意一种标签蛋白的碱基序列：his标签、flag标签、myc标签、ha标签、egfp标签。

4、上述黄颡鱼sumo化修饰体系的构建方法，包括以下步骤：

5、1)以黄颡鱼全长cdna为模板进行pcr扩增，得到融合蛋白基因的pcr产物；

6、2)以所述融合蛋白基因的pcr产物为模板进行第二轮pcr扩增，得到两端含同源重组连接位点同源臂碱基的融合蛋白基因的pcr产物；

7、3)使用限制性内切酶对pcdna3.1(+)真核表达质粒载体的hindiii和xho i酶切位点进行双酶切，得到线性化的pcdna3.1(+)真核表达质粒载体；

8、4)将第二轮pcr产物与线性化的pcdna3.1(+)真核表达质粒载体进行同源重组，将得到的重组产物分别转化进新鲜的dh5α感受态大肠杆菌细胞，得到含融合蛋白基因的pcdna3.1(+)真核表达质粒载体。

9、优选地，所述步骤1)中：

10、当融合蛋白基因为3’端带表达myc标签碱基的myc-sumo1时，myc-sumo1的pcr扩增引物如下：

11、myc-sumo1上游引物：tctaatctcctccttactcca；

12、myc-sumo1下游引物：ctacagatcctcttcagagatgagtttctgctcgtcgttccagt；

13、或者，当融合蛋白基因为3’端带表达myc标签碱基的myc-sumo2时，myc-sumo2的pcr扩增引物如下：

14、myc-sumo2上游引物：ttcagccaatcgtagagca；

15、myc-sumo2下游引物：tcacagatcctcttcagagatgagtttctgctcaatcacacctcc；

16、或者，当融合蛋白基因为3’端带表达myc标签碱基的myc-sumo3时，myc-sumo3的pcr扩增引物如下：

17、myc-sumo3上游引物：ttaacagcgcatcttgtgtaa；

18、myc-sumo3下游引物：ctacagatcctcttcagagatgagtttctgctcgcgatggccgcccgtt；

19、或者，当融合蛋白基因为3’端带表达his标签碱基的his-sae1时，his-sae1的pcr扩增引物如下：

20、his-sae1上游引物：ttgaatgggcagcgatag；

21、his-sae1下游引物：tcaatggtgatggtgatgatgttttcctccaaagtactcca；

22、或者，当融合蛋白基因为3’端带表达his标签碱基的his-uba2时，his-uba2的pcr扩增引物如下：

23、his-uba2上游引物：gcgccaaaactaaataagctg；

24、his-uba2下游引物：ctaatggtgatggtgatgatggtctagagcgatgaggtcgt；

25、或者，当融合蛋白基因为3’端带表达his标签碱基的his-ubc9时，his-ubc9的pcr扩增引物如下：

26、his-ubc9上游引物：actgtttggagtttcattcacc；

27、his-ubc9下游引物：ttaatggtgatggtgatgatggggagaaaactttttggcttg；

28、或者，当融合蛋白基因为3’端带表达his标签碱基的his-pias1时，his-pias1的pcr扩增引物如下：

29、his-pias1上游引物：agggaactacaagatggcg；

30、his-pias1下游引物：tcaatggtgatggtgatgatggtctagggagatgatatcgg；

31、或者，当融合蛋白基因为3’端带表达ha标签碱基的ha-zip8时，ha-zip8的pcr扩增引物如下：

32、ha-zip8上游引物：gttcactgcgacagaagacac；

33、ha-zip8下游引物：tcaagcgtaatctggaacatcgtatgggtagcccaggttaat；

34、优选地，所述步骤2)中：

35、当融合蛋白基因为3’端带表达myc标签碱基的myc-sumo1时，含同源重组连接位点同源臂碱基的融合蛋白基因cz-myc-sumo1的pcr扩增引物如下：

36、cz-myc-sumo1上游引物：ctagcgtttaaacttaagcttatgtcagacacggagacaaaacc；

37、cz-myc-sumo1下游引物：aacgggccctctagactcgagctacagatcctcttcagagatgagtttc；

38、或者，当融合蛋白基因为3’端带表达myc标签碱基的myc-sumo2时，含同源重组连接位点同源臂碱基的融合蛋白基因cz-myc-sumo2的pcr扩增引物如下：

39、cz-myc-sumo2上游引物：ctagcgtttaaacttaagcttatggcggacgagaagccc；

40、cz-myc-sumo2下游引物：aacgggccctctagactcgagtcacagatcctcttcagagatgagtt；

41、或者，当融合蛋白基因为3’端带表达myc标签碱基的myc-sumo3时，含同源重组连接位点同源臂碱基的融合蛋白基因cz-myc-sumo3的pcr扩增引物如下：

42、cz-myc-sumo3上游引物：ctagcgtttaaacttaagcttatgtctgaggataagcccaagg；

43、cz-myc-sumo3下游引物：aacgggccctctagactcgagctacagatcctcttcagagatgagtttc；

44、或者，当融合蛋白基因为3’端带表达his标签碱基的his-sae1时，含同源重组连接位点同源臂碱基的融合蛋白基因cz-his-sae1的pcr扩增引物如下：

45、cz-his-sae1上游引物：ctagcgtttaaacttaagcttatgattgatacaatcgaaaaagacga；

46、cz-his-sae1下游引物：aacgggccctctagactcgagtcaatggtgatggtgatgatgttt；

47、或者，当融合蛋白基因为3’端带表达his标签碱基的his-uba2时，含同源重组连接位点同源臂碱基的融合蛋白基因cz-his-uba2的pcr扩增引物如下：

48、cz-his-uba2上游引物：ctagcgtttaaacttaagcttatggaggtgaaactagacggacc；

49、cz-his-uba2下游引物：aacgggccctctagactcgagctaatggtgatggtgatgatggtc；

50、或者，当融合蛋白基因为3’端带表达his标签碱基的his-ubc9时，含同源重组连接位点同源臂碱基的融合蛋白基因cz-his-ubc9的pcr扩增引物如下：

51、cz-his-ubc9上游引物：ctagcgtttaaacttaagcttatgtctggtatagcgctgagtcg；

52、cz-his-ubc9下游引物：aacgggccctctagactcgagttaatggtgatggtgatgatggg；

53、或者，当融合蛋白基因为3’端带表达his标签碱基的his-pias1时，含同源重组连接位点同源臂碱基的融合蛋白基因cz-his-pias1的pcr扩增引物如下：

54、cz-his-pias1上游引物：ctagcgtttaaacttaagcttatggcggagagcgcggaa；

55、cz-his-pias1下游引物：aacgggccctctagactcgagtcaatggtgatggtgatgatgg；

56、或者，当融合蛋白基因为3’端带表达ha标签碱基的ha-zip8时，含同源重组连接位点同源臂碱基的融合蛋白基因cz-ha-zip8的pcr扩增引物如下：

57、cz-ha-zip8上游引物：ctagcgtttaaacttaagcttatgaacgactttatcatcctctgtgc；

58、cz-ha-zip8下游引物：aacgggccctctagactcgagtcaagcgtaatctggaacatcg。

59、一种黄颡鱼sumo化靶标蛋白sumo化修饰位点突变融合蛋白表达质粒的构建方法，包括以下步骤：

60、1)根据sumo化修饰的作用位点机理，利用sumoplot在线网站预测黄颡鱼sumo化靶标蛋白zip8中可能存在的sumo化修饰位点，分别位于zip8氨基酸上k24、k192和k222位；以上述三个位点中任意一个进行突变设计引物，将赖氨酸突变为精氨酸，

61、当突变位点为k24时，设计引物ha-zip8-k24r如下：

62、ha-zip8-k24r上游引物：ggtttcgagctgagactttacacaatgatttcct；

63、ha-zip8-k24r下游引物：agtctcagctcgaaacccgggagcttgacttag；

64、或者，当突变位点为k192时，设计引物ha-zip8-k192r如下：

65、ha-zip8-k192r上游引物：tgacccgcgaaaagataactacatcacgaaggctgt；

66、ha-zip8-k192r下游引物：tatcttttcgcgggtcaaaccccagagcctca；

67、或者，当突变位点为k222时，设计引物ha-zip8-k222r如下：

68、ha-zip8-k222r上游引物：tgatcctacgaaccgacgaagagcacggccac；

69、ha-zip8-k222r下游引物：gtcggttcgtaggatcatcttcaggatcctctcc。

70、2)以上述含ha-zip8融合蛋白基因的pcdna3.1(+)真核表达质粒载体为模板，采用上述任意一对引物进行pcr反应，扩增获得编码zip8蛋白第24位或192位或222位赖氨酸突变为精氨酸的线性化的融合蛋白表达质粒pcr产物；

71、3)将得到的线性化的融合蛋白表达质粒pcr产物直接进行同源重组，将重组产物转化到dh5α感受态大肠杆菌细胞，即得到zip8蛋白24位或192位或222位sumo化修饰位点突变融合蛋白表达质粒。

72、一种重组细胞，所述重组细胞为含有上述黄颡鱼sumo化修饰体系或含有上述构建方法制备的黄颡鱼sumo化修饰体系或含有上述构建方法制备的突变融合蛋白表达质粒的宿主细胞；所述宿主细胞为hek 293t、hepg2或hela。

73、下列任意一项在调控黄颡鱼锌吸收转运中的应用：

74、1)包括一个或多个上述黄颡鱼sumo化修饰体系；

75、2)包括一个或多个上述重组细胞。

76、下列任意一项在黄颡鱼养殖效益提高、免疫应答优化、疾病抗性增强中的应用：

77、1)包括一个或多个上述黄颡鱼sumo化修饰体系；

78、2)包括一个或多个上述重组细胞。

79、注：上述步骤中仅展示了黄颡鱼sumo化靶标蛋白sumo化修饰位点突变融合蛋白表达质粒其中一个zip8蛋白k24位点突变的构建方法，该方法不局限于zip8蛋白，可同时适用于其他sumo化靶标蛋白，也不局限zip8蛋白的k24位点，可同时适用于其他sumo化靶标蛋白的sumo化修饰位点。

80、注：本发明中黄颡鱼sumo化修饰体系不只是含目的基因和标签蛋白的融合蛋白表达质粒，还包括以下任何一种：

81、a.编码如上述的含相应标签蛋白和目的蛋白的多核苷酸；

82、b.含有a所述的多核苷酸的重组融合蛋白表达质粒载体；

83、c.含有b所述的重组融合蛋白表达质粒载体的生物工程菌。

84、本发明中，通过免疫荧光技术检测细胞内sumo化修饰强弱的方法为：通过设置对照组实验，向目标细胞中转入所需的含目的基因和标签蛋白的融合蛋白表达质粒，培养细胞后得到表达融合蛋白的细胞，根据转入蛋白的标签不同，使用不同的一抗和荧光二抗对细胞进行免疫荧光染色，使不同蛋白在细胞内呈现不同的荧光，利用激光共聚焦显微镜等仪器检测细胞中荧光信号的强度和细胞定位情况，可在细胞内鉴定各个黄颡鱼sumo化修饰相关蛋白的表达强弱情况、各个蛋白之间的互作结合及共定位强弱，以实现对细胞内sumo化修饰的可视化检测和亚细胞定位。

85、本发明中，细胞内sumo化修饰相关融合蛋白的提取方法，该方法提取的蛋白可用于后续的免疫沉淀、免疫共沉淀和免疫印迹等蛋白实验，包括以下步骤：

86、1)准备细胞sumo化修饰裂解缓冲液：

87、裂解液配制方法为：50mm tris-hcl(ph 7.5)，150mm氯化钠，0.2％曲拉通x-100，1％4-壬基苯基-聚乙二醇，0.5％脱氧胆酸钠，4mm乙二胺四乙酸，1mm乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，1mm苯甲基磺酰氟，5mm二硫苏糖醇，1mm正钒酸钠，5mm氟化钠，20mm n-乙基马来酰亚胺，10mm碘乙酰胺。

88、2)细胞的收集及蛋白的提取：

89、使用预冷的pbs清洗细胞2次，2000rpm4℃离心3分钟收集待测细胞(以hek293t为例)2×106cells，加入0.4±0.1ml的细胞sumo化修饰裂解缓冲液，在冰上超声破碎12-15秒(超声3秒，停3秒)，并在冰上放置裂解30分钟，12000g 4℃离心10分钟，吸取上清液即为提取的细胞蛋白；所述待测细胞为含有通过上述黄颡鱼sumo化修饰体系进行sumo化修饰后的靶标蛋白的细胞或上述重组细胞或含有上述黄颡鱼sumo化靶标蛋白sumo化修饰位点突变融合蛋白表达质粒的细胞。

90、本发明中，筛选黄颡鱼sumo化靶标蛋白的方法为：利用ubc9是sumo化修饰过程中目前已知唯一的e2结合酶这一特点，将含待测黄颡鱼sumo化靶标蛋白的融合蛋白表达质粒与ubc9融合蛋白表达质粒共同转入hek 293t细胞中，培养并表达目的蛋白后，采用免疫荧光或者免疫共沉淀的方法检测，若待测蛋白与ubc9存在明显的共定位或者互作，则表示待测蛋白为黄颡鱼sumo化靶标蛋白，若没有明显的共定位或者互作结果，则表明待测蛋白不是黄颡鱼sumo化靶标蛋白，从而可以及时准确地鉴定黄颡鱼sumo化靶标蛋白。

91、本发明中，鉴定黄颡鱼sumo化靶标蛋白与sumo1、sumo2、sumo3结合能力强弱的方法为：利用sumo化靶标蛋白发生sumo化修饰后会导致靶蛋白和sumo蛋白结合形成复合物的特点，将含待测黄颡鱼sumo化靶标蛋白和ubc9的融合蛋白表达质粒分别与sumo1、sumo2、sumo3融合蛋白表达质粒共同转入hek 293t细胞中，培养并表达目的蛋白后，采用免疫沉淀的方法检测，根据实验结果呈现的靶蛋白和sumo蛋白结合形成复合物的多少，从而可以及时准确地展现黄颡鱼sumo化靶标蛋白与sumo1、sumo2、sumo3结合能力的强弱。

92、本发明中，研究黄颡鱼sumo化靶标蛋白发生sumo化修饰作用机理的方法为：通过设置对照组实验，向目标细胞中转入所需的含目的基因和标签蛋白的融合蛋白表达质粒(利用上述步骤中构建的融合蛋白表达质粒)，培养细胞后得到表达融合蛋白的细胞，采用免疫荧光、免疫共沉淀、免疫沉淀等方法检测实验结果，可用于研究黄颡鱼sumo e1活化酶、e2结合酶、e3连接酶对黄颡鱼sumo化靶标蛋白发生sumo化修饰的影响。

93、本发明中，鉴定黄颡鱼sumo化靶标蛋白的主效sumo化修饰位点的方法为：利用ubc9直接辨识底物蛋白中的保守序列ψ-kxd/e这一原理，若将sumo化靶标蛋白上的sumo修饰位点突变掉，则突变的sumo化靶标蛋白就不能发生sumo化修饰，也就不会使靶蛋白和sumo蛋白结合形成复合物，将含待测野生型和位点突变型黄颡鱼sumo化靶标蛋白和ubc9的融合蛋白表达质粒与sumo融合蛋白表达质粒共同转入hek 293t细胞中，培养并表达目的蛋白后，采用免疫沉淀的方法检测，根据实验结果呈现的靶蛋白和sumo蛋白结合形成复合物的有无和多少，从而可以及时准确地鉴定出黄颡鱼sumo化靶标蛋白的主效sumo化修饰位点。

94、本发明中，测评某处理对黄颡鱼sumo化修饰相关蛋白或sumo化靶蛋白sumo化修饰程度影响的方法为：通过设置对照组实验，向目标细胞中转入所需的含目的基因和标签蛋白的融合蛋白表达质粒(利用上述步骤中构建的融合蛋白表达质粒)，将待测处理作用于细胞，培养细胞后得到表达融合蛋白的细胞，采用免疫荧光、免疫共沉淀、免疫沉淀等方法检测实验结果，可用于研究影响黄颡鱼sumo化修饰的激活剂和抑制剂的作用机制或开发相关产品和药物；上述待测处理可为化合物质和生物分子物质(如核酸或蛋白)，若为化合物质，则为将化合物加入到细胞培养基中进行培养；若为生物分子物质，则为将核酸或含有该蛋白对应编码基因的载体质粒通过转染导入细胞中。

95、本发明的有益效果：

96、(1)本发明首次构建了黄颡鱼sumo化修饰体系，能够根据实验需求，以高效且便捷的方式，在hek 293t等工具细胞中单独或联合稳定表达黄颡鱼sumo化修饰中各个关键蛋白，利用蛋白质相关研究技术，如免疫荧光、免疫沉淀、免疫共沉淀和免疫印迹实验，对实验结果进行检测和分析。所表达的融合蛋白可根据需要融合不同的标签蛋白，很好的解决了采用活体样品分析蛋白质样品时出现的抗体短缺或者无特异性抗体等问题，特别是在研究一些非常见模式生物时，能够十分方便的研究任意蛋白之间的作用关系，从而节约了大量的时间和费用。

97、(2)本发明通过将sumo化修饰相关融合蛋白表达质粒在hek 293t细胞内共表达，并优化了细胞sumo化修饰裂解缓冲液，科学合理的添加了蛋白酶抑制剂、去sumo化酶抑制剂等，有效抑制了蛋白的降解，并维持了原有的蛋白质之间相互作用，提高了sumo化修饰相关蛋白的丰度，显著提高了可检测到的sumo化修饰水平和检测灵敏度，降低了背景信号和假阳性，实现了体外高效鉴定黄颡鱼的sumo化修饰。

98、(3)本发明利用免疫荧光技术，根据转入蛋白的标签不同，使用不同的一抗和荧光二抗对细胞进行免疫荧光染色，使不同蛋白在细胞内呈现不同的荧光，基于荧光成像，我们能够在时间和空间两个维度上同时观察和检测靶蛋白的sumo化修饰，更真实地反映体内底物结合情况，这为研究目标蛋白的sumo化修饰提供了一种生动直观的方法。

99、(4)本发明利用分子生物学方法，提出了构建所有与黄颡鱼sumo化修饰相关的融合蛋白表达质粒的方法，利用免疫荧光、免疫共沉淀、免疫沉淀等方法检测蛋白水平的sumo化，可以大规模筛选黄颡鱼sumo化修饰靶蛋白，同时可研究黄颡鱼sumo e1活化酶、e2结合酶、e3连接酶之间的关系并鉴定与之相结合的底物蛋白，有利于丰富黄颡鱼整个sumo化修饰信号通路的理论，为相关的基础研究奠定理论基础。

100、(5)本发明采用分子生物学技术，提出了构建黄颡鱼sumo化修饰靶蛋白sumo化修饰位点突变融合蛋白表达质粒的方法，将黄颡鱼sumo化修饰的研究引入到了dna分子和蛋白质结构水平，能够鉴定出靶蛋白sumo化修饰主效位点，有利于通过对主效位点的介入，调控靶蛋白的生物学功能，从而开发相关的药物和治疗手段等。

101、(6)本发明能够快速建立起sumo化相关抑制剂或激活剂对sumo修饰影响的评价体系，有利于大规模的筛选抑制剂和激活剂并研究其作用机理，同时也为研究饲料对鱼类锌转运蛋白生物学功能的调控，提高鱼类对锌的利用能力、降低饲料成本和保障鱼类生长性能具有重大意义。本发明首次提出了鱼类sumo化修饰分析技术的方法，为其他水生生物和模式生物sumo化修饰分析技术的建立和创新提供了指导。