一种重组人源化III型胶原蛋白及其制备方法与流程

本发明属于生物工程，涉及一种重组人源化iii型胶原蛋白序列及其制备方法。

背景技术：

1、人体皮肤、筋膜、肌腱中含有一种细小的胶原蛋白，叫做iii型胶原蛋白。它占总胶原蛋白的四分之一，主要分布在表皮层和真皮层的交界处。iii型胶原蛋白是构成皮肤网状纤维的重要成分，它能使纤维束变得细密，在伤口愈合的过程中，如果iii型胶原蛋白含量高，就能让皮肤更加光滑细腻。人体无法自行合成或增加iii型胶原蛋白，只能通过向真皮层注入来补充流失的iii型胶原蛋白。iii型胶原蛋白的作用是支撑皮肤的柔软度和弹性，让皮肤看起来嫩滑有光泽。伤口恢复后，iii型胶原蛋白还能减少疤痕的形成，具有广阔的应用前景。

2、早期胶原蛋白主要指的是从动物源(如鱼、猪、牛等)中提取的胶原蛋白，存在较多缺点。首先它通常只有i型，而其他型的提取成本太高。同时天然胶原蛋白的氨基酸序列和人体不完全相同，可能引起免疫排斥反应或过敏反应。特别是含有端肽或α-gal抗原的胶原蛋白，免疫原性较高，并且可能受到动物源性疾病(如疯牛病、口蹄疫等)的污染，造成人畜共患病的风险。天然胶原蛋白在不同的ph值、温度、离子强度等条件下，可能发生变性、降解或交联等反应，影响其理化性质和生物活性且分子量较大，不易被皮肤或组织吸收，需要通过水解或酶解等方法降低分子量。鉴于天然胶原存在的种种缺点以及市场对胶原蛋白的巨大需求量，利用基因工程技术大规模生产低成本，低免疫原性，低风险及稳定分子量的重组胶原蛋白是一个极有意义的研究方向。

3、基因工程技术中主要设计的表达宿主有，大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞。其中原核表达系统表达的外源蛋白往往以不溶性的包涵体形式存在，需要复杂的重折叠过程才能恢复活性，宿主含有内毒素和有毒蛋白，可能污染表达产物，影响其安全性和应用范围，且内源性蛋白酶易降解外源蛋白，导致表达产物不稳定。而昆虫细胞和哺乳动物细胞表达体系建立慢，生产周期长，生产成本高，难以满足产业化需求。相较而言，酵母表达体系是一种经济、高效、多功能的微生物表达系统，已经成功地应用于多种重组蛋白的生产，如人血清白蛋白、乙型肝炎疫苗、干扰素、胰蛋白酶等。将其应用于重组胶原蛋白的生产具有客观的现实意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，本发明首先提供了一种重组人源化iii型胶原蛋白，是如下a)或b)的重组人源化iii型胶原蛋白：

2、a)氨基酸序列是seq id no.1的重组人源化iii型胶原蛋白；

3、b)将seq id no.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有重组人源化iii型胶原酶活性的蛋白。

4、本发明还提供了与上述蛋白相关的生物材料，为下述b1)至b8)中的任一种：

5、b1)编码权利要求1所述蛋白的核酸分子；

6、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

7、b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体，

8、b4)含有b2)所述表达盒的重组载体；

9、b5)含有b1)所述核酸分子的重组微生物；

10、b6)含有b2)所述表达盒的重组微生物；

11、b7)含有b3)所述重组载体的重组微生物；

12、b8)含有b4)所述重组载体的重组微生物；

13、任选地，所述载体包括酵母表达载体；

14、任选地，所述重组微生物包括工程菌或酵母细胞。

15、优选地，所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)所示的核酸分子：

16、1)编码序列是序列表中seq id no.2的dna分子或cdna分子；

17、2)核酸序列是序列表中seq id no.2的dna分子；

18、3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白的cdna分子或基因组dna分子；

19、4)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白的cdna分子或基因组dna分子。

20、本发明还提供了上述的蛋白在支撑皮肤、伤口恢复和/或减少疤痕中的应用，所述应用为非治疗目的的。

21、本发明还提供了上述的生物材料在制备重组人源化iii型胶原蛋白中的应用。

22、本发明还提供了一种重组毕赤酵母工程菌株制备方法，包含以下步骤：通过基因合成的方式合成重组人源化iii型胶原的编码基因后，利用同源重组技术，将目的基因克隆到ppick质粒的分泌信号肽下游，通过pcr及基因测序验证正确后抽提质粒，用限制性内切酶线性化后电转至毕赤酵母电转感受态细胞中，通过梯度g418筛选获得高表达重组人源化iii型胶原蛋白的重组毕赤酵母工程菌株。

23、优选地，所述重组人源化iii型胶原的编码基因的序列如seq id no.2所示。

24、本发明还提供了一种重组人源化iii型胶原蛋白制备方法，包含以下步骤：利用上述的生物材料，得到重组人源化iii型胶原蛋白。

25、本发明最后提供了一种用于支撑皮肤、伤口恢复和/或减少疤痕的生物合成产品，所述产品包括权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的生物材料。

26、本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

27、本发明从iii型人胶原蛋白序列中通过筛选和改造，获得水溶性强且性质稳定的氨基酸序列，根据毕赤酵母密码子偏好性及屏蔽限制性内切酶酶切位点进行密码子优化，得到优化后的重组人源化iii型胶原蛋白毕赤酵母表达基因，通过同源重组构建到毕赤酵母分泌表达质粒中，通过电转筛选得到高表达人源化iii型胶原的重组毕赤酵母工程菌株。经优化后的发酵培养及纯化，最终得到高纯度的重组人源化iii型胶原蛋白。本发明相对于常规的发酵手段能够显著提升上述重组人源化iii型胶原蛋白的表达量，在生物医用材料和化妆品等领域具有潜在的应用前景。

技术特征：

1.一种重组人源化iii型胶原蛋白，是如下a)或b)的重组人源化iii型胶原蛋白：

2.与权利要求1所述蛋白相关的生物材料，为下述b1)至b8)中的任一种：

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)所示的核酸分子：

4.权利要求1所述的蛋白在支撑皮肤、伤口恢复和/或减少疤痕中的应用，所述应用为非治疗目的的。

5.权利要求2所述的生物材料在制备重组人源化iii型胶原蛋白中的应用。

6.一种重组毕赤酵母工程菌株制备方法，其特征在于，包含以下步骤：通过基因合成的方式合成重组人源化iii型胶原的编码基因后，利用同源重组技术，将目的基因克隆到ppick质粒的分泌信号肽下游，通过pcr及基因测序验证正确后抽提质粒，用限制性内切酶线性化后电转至毕赤酵母电转感受态细胞中，通过梯度g418筛选获得高表达重组人源化iii型胶原蛋白的重组毕赤酵母工程菌株。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述重组人源化iii型胶原的编码基因的序列如seq id no.2所示。

8.一种重组人源化iii型胶原蛋白制备方法，其特征在于，包含以下步骤：利用权利要求2所述的生物材料，得到重组人源化iii型胶原蛋白。

9.一种用于支撑皮肤、伤口恢复和/或减少疤痕的生物合成产品，所述产品包括权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的生物材料。

技术总结本发明公开了一种重组人源化III型胶原蛋白，是如下a)或b)的重组人源化III型胶原蛋白：a)氨基酸序列是SEQ ID No.1的重组人源化III型胶原蛋白；b)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有重组人源化III型胶原酶活性的蛋白。本发明根据毕赤酵母密码子偏好性及屏蔽限制性内切酶酶切位点进行密码子优化，得到优化后的重组人源化III型胶原蛋白毕赤酵母表达基因，通过同源重组构建到毕赤酵母分泌表达质粒中，通过电转筛选得到高表达人源化III型胶原的重组毕赤酵母工程菌株。本发明相对于常规的发酵手段能够显著提升上述重组人源化III型胶原蛋白的表达量，在生物医用材料和化妆品等领域具有潜在的应用前景。技术研发人员：闵真真,刘洋,陆梦晓,毛伟超,黄露漫,龙红艳,吴明远,马丁·约翰·埃文斯受保护的技术使用者：湘雅生物医药（湖州）有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18