靶向S蛋白的纳米抗体制备及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域。更特别地，涉及一种可靶向结合mers-cov的s蛋白的多肽，还涉及所述多肽在制备mers-cov感染的治疗药物和诊断剂中的应用。

背景技术：

1、中东呼吸综合征(middle east respiratory syndrome,mers)首先发现于2012年6月一名死亡的60岁沙特阿拉伯男性患者。该病的潜伏期为2至14天，典型表现为急性呼吸道感染，起病急，高热(39-40℃)，可伴有畏寒、寒战、咳嗽、胸痛、头痛、全身肌肉关节酸痛、乏力、食欲减退等症状。目前尚无可用的疫苗和特异性治疗方法。虽然该病最初发生在中东地区，但随着贸易、旅游、宗教等的活动的开展，逐渐蔓延到欧洲、非洲、亚洲和北美洲等27个国家。因此，开发安全有效的中和抗体在mers-cov疫情防控中有重要的公共卫生意义。

2、mers-cov属于β冠状病毒属(β-cov)的一种有包膜的单股正链rna病毒，其单链rna基因组的大小约30kb,共有10个开放阅读框(orf)，编码16种非结构蛋白(nsp1-16)和四种结构蛋白：刺突蛋白(s)、包膜蛋白(e)、基质蛋白(m)和核衣壳蛋白(n)。四种结构蛋白组成球形、似王冠样病毒颗粒，其中s和n具有很强的免疫原性。s蛋白为三聚体状态的ⅰ型跨膜糖蛋白，位于病毒膜表面，介导病毒附着宿主细胞及病毒-细胞膜的融合，是细胞靶向性和发病机制的主要决定因子。s蛋白能够诱导机体产生中和抗体，该抗体在预防mers-cov感染中发挥关键作用。因此，以s蛋白免疫动物，并从中筛选有中和活性的抗体将是治疗mers-cov感染的有效策略之一。

3、1993年，一种来源于骆驼科的新型天然抗体被发现。该抗体天然缺失轻链而只由重链组成，其重链包含两个恒定区(ch2和ch3)、一个铰链区和一个重链可变区(variableheavy chain domain，vhh，即抗原结合位点)，该重链可变区的相对分子质量约为13kda，仅为常规抗体的1/10，且分子高度和直径均在纳米级别，是目前可获得的最小的功能性抗体片段，因此又被称为纳米单抗(nanobody，nb)。因纳米单抗稳定性高(90℃条件下仍不会降解)、亲和力高、与人源抗体同源性超过80％、毒性和免疫原性均较低等特点，最近纳米单抗被广泛用于免疫诊断试剂盒研发、影像学研发以及针对肿瘤、炎症、传染病和神经系统疾病等领域的抗体药物研发。

4、我们期望通过纳米抗体新技术，筛选获得能够有效预防和治疗mers-cov的中和抗体。

技术实现思路

1、本发明通过用抗原免疫骆驼，获取骆驼源纳米单抗，用于检测和治疗mers-cov感染。基于这些研究，本发明提供了一种可结合mers-cov的多肽，包括3个互补决定区cdr1-3，序列如seq id no:1-3所示。

2、在一个具体实施方案中，所述多肽为纳米抗体。

3、在一个具体实施方案中，所述多肽还包括4个框架区fr1-4，所述fr1-4与所述cdr1-3按顺序交错排列。例如，可将fr1-4序列设计为如seq id no:4-7所示(羊驼源)，但本发明的范围不限于此。抗体的特异性识别和结合能力主要由cdr区序列决定，fr序列影响不大，可根据物种来设计，这是本领域公知的。可设计人源、鼠源或骆驼源的fr区序列来连接上述cdr，从而得到一个可结合mers-cov的纳米抗体。

4、在一个具体实施方案中，所述多肽为骆驼源的vhh或人源化的vhh。

5、本发明还提供了上述多肽在制备mers-cov的检测剂或mers-cov的s蛋白的检测剂中的应用。

6、本发明还提供了上述多肽在制备mers-cov治疗药物中的应用。

7、本发明还提供了编码上述多肽的核酸。

8、本发明还提供了上述核酸在制备mers-cov治疗药物中的应用。

9、本发明针对mers-cov进行纳米抗体药物开发，通过制备mers-cov s蛋白、免疫双峰骆驼、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合mers-cov的纳米抗体vhh，鉴定了其cdr序列，并构建了人源化的vhh-hufc1；同时利用假病毒中和实验评估nbm67在治疗mers-cov感染的疗效，为mers-cov感染的防治提供了潜在的检测剂和治疗药物。

技术特征：

1.一种可结合mers-cov的多肽，其特征在于，包括3个互补决定区cdr1-3，序列如seqid no:1-3所示。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽为纳米抗体。

3.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于，还包括4个框架区fr1-4，所述fr1-4与所述cdr1-3按顺序交错排列。

4.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述多肽为骆驼源的vhh或人源化的vhh。

5.权利要求1-4中任一项所述的多肽在制备mers-cov的检测剂或mers-cov的s蛋白的检测剂中的应用。

6.权利要求1-4中任一项所述的多肽在制备mers-cov感染的治疗药物中的应用。

7.一种核酸，其特征在于，编码权利要求1-4中任一项所述的多肽。

8.权利要求7所述的核酸在制备mers-cov感染的治疗药物中的应用。

技术总结本发明涉及一种可识别和中和MERS‑CoV的多肽NbM67，包括3个互补决定区CDR1‑3，序列如SEQ ID NO:1‑3所示。本发明针对MERS‑CoV进行纳米抗体药物开发，通过制备MERS‑CoV S蛋白、免疫双峰骆驼、利用噬菌体库展示纳米单抗的平台技术等，筛选到特异性结合MERS‑CoV的纳米抗体VHH，鉴定了其CDR序列，并构建了人源化的VHH‑huFc1；同时利用假病毒中和实验评估NbM67在治疗MERS‑CoV感染的疗效，结果显示当抗体浓度在0.0627μg/ml时，抑制率能达到90％。因此，本发明为MERS‑CoV感染的防治提供了潜在的检测剂和治疗药物。技术研发人员：公伟,贾占军,张爱华,黄松明,单鸣凤,朱林静受保护的技术使用者：南京市儿童医院技术研发日：技术公布日：2024/6/18